抑制低氧外泌體miR-423-3p通過限制星形膠質(zhì)細胞的自噬來減少膠質(zhì)瘤的進展

         膠質(zhì)瘤的腫瘤微環(huán)境（TME）包括膠質(zhì)瘤細胞和周圍的細胞，如星形細胞、巨噬細胞、T細胞和神經(jīng)元。在TME中，膠質(zhì)瘤細胞可以通過分泌外泌體來激活正常人類星形細胞（NHAs），而星形細胞的激活可以進一步促進膠質(zhì)瘤的進展，導致患者預后不良。然而，膠質(zhì)瘤激活NHAs的分子機制在很大程度上仍然未知。在這項研究中，膠質(zhì)瘤衍生的外泌體（GDEs）在調(diào)節(jié)自噬和激活NHAs中起著重要作用。與常氧GDEs相比，缺氧膠質(zhì)瘤衍生的外泌體（H-GDEs）進一步改善了星形細胞的自噬和激活，這極大地促進了膠質(zhì)瘤細胞的進展。在來自膠質(zhì)瘤的兩種外泌體之間的miRNA陣列中，miR-423-3p在H-GDEs中高表達，并在自噬中發(fā)揮了重要作用，導致NHAs的激活。確定了缺氧膠質(zhì)瘤細胞與NHAs反應以創(chuàng)建免疫抑制微環(huán)境的機制，并建立了15d-PGJ2作為抑制miR-423-3p以抑制NHAs激活的有效抑制劑。這些發(fā)現(xiàn)為通過靶向自噬和miR-423-3p表達提供了對膠質(zhì)瘤診斷和治療的新見解。本文于2025年4月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術路線：

結果：

1）H-GDEs誘導體外NHAs細胞自噬

         為了研究GDEs對星形細胞功能的影響，從在常氧（N-GDEs）和缺氧（H-GDEs）條件下培養(yǎng)的U251和P3#GBM細胞中提取了GDEs。透射電子顯微鏡（TEM）顯示，從上清液中提取的內(nèi)容物是直徑為30-100 nm的圓形物體（圖1A），這表明外泌體的成功提取。此外，Western blotting顯示，在提取的囊泡中，外泌體標記物的表達豐富，包括CD9和TSG101，而calnexin未被檢測到（圖1B）。由于假設缺陷自噬會觸發(fā)反應性星形細胞，因此研究了GDEs對星形細胞中自噬的影響。使用TEM測量自噬體的形成。與N-GDE處理相比，H-GDE處理后的自噬體體積顯著增加（圖1C，D）。使用Western blotting檢測NHA中與自噬相關的分子LC3B和P62的表達（圖1E）。N-GDEs和H-GDEs均增加了NHA中的自噬，其中H-GDEs處理的星形細胞中自噬增加更為顯著，這表明GDEs直接影響星形細胞中的自噬。同樣，根據(jù)免疫熒光染色，星形細胞在暴露于來自U251和P3#GBM（圖1F）的H-GDEs后，其內(nèi)的LC3B增加。使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬減弱了H-GDE處理的NHA中LC3B的表達，進一步證實H-GDEs促進星形細胞中的自噬（圖1G）。此外，進行了siRNA介導的beclin1敲除，并使用Western blotting驗證了這種敲除的有效性作為抑制自噬的替代方法。與3-MA處理一致，beclin1的敲除導致LC3B類似的下調(diào)（圖1H）。值得注意的是，3-MA和beclin1沉默均有效逆轉(zhuǎn)了H-GDE誘導的自噬體組裝（圖1I，J）。此外，Western blotting顯示，在使用這些抑制劑治療后，LC3B的表達如預期的那樣下調(diào)，同時P62的表達上調(diào)（圖1K）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了H-GDEs誘導星形膠質(zhì)細胞自噬的能力。

2）H-GDEs比N-GDEs更能誘導NHAs活化

         鑒于GDEs可以誘導NHA中的自噬，因此確定了GDEs對星形細胞功能的后續(xù)影響。使用EdU和Transwell測定，我們發(fā)現(xiàn)N-GDEs和H-GDEs均增強了NHA的增殖和遷移，其中H-GDEs的效果比N-GDEs更強（圖2A，C，E）。ELISA顯示，NHA增殖和遷移的增加伴隨著H-GDE處理的細胞中IL-6和IL-8分泌的顯著增加（圖2I）。GFAP是反應性星形細胞的經(jīng)典標記物，因此，在用N-GDEs和H-GDEs處理后評估了GFAP的表達。研究結果顯示，NHA在暴露于H-GDEs后，GFAP表達顯著上調(diào)（圖1G），證實了H-GDEs在星形細胞激活中的強效前反應作用。接下來，研究了自噬是否在這一轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用。在H-GDE處理的組中，通過3-MA抑制自噬或敲低beclin1減弱了H-GDE誘導的IL-6和IL-8的分泌（圖2J）。然后研究了GDEs暴露后NHA中觀察到的功能變化是否由自噬介導。EdU和Transwell測定還顯示，自噬的下調(diào)阻斷了H-GDEs對NHA增殖和遷移的影響（圖2B，D，F）。此外，Western blotting揭示，通過3-MA或beclin1的基因敲低實現(xiàn)的抑制自噬，導致GFAP表達顯著降低（圖2G）。總的來說，這些結果強烈表明H-GDEs可以通過調(diào)節(jié)自噬誘導NHA轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻硇汀?/span>

3）H-GDEs通過miR-423-3p誘導NHAs細胞自噬，其作用可被3-MA抑制

         外泌體可以在細胞之間運輸miRNAs 。為了確定導致NHA轉(zhuǎn)化的GDE相關的miRNA，使用miRNA陣列分析了來自U251和P3#GBM細胞的N-GDEs和H-GDEs中的miRNA含量（圖3A）。比較了N-GDEs和H-GDEs中差異表達的miRNA，并鑒定了從兩種細胞系中提取的H-GDEs中高表達的top 10 miRNA（圖3B）。確定了這10個miRNA對NHA中自噬調(diào)節(jié)的影響。MiR-423-3p顯著提高了NHA中LC3B的表達，通過半定量測量（圖3C，D），表明其在調(diào)節(jié)自噬中的重要作用。對來自P3#GBM細胞（圖3E）的N-GDEs和H-GDEs進行了qRT-PCR，證實了miR-423-3p的上調(diào)。此外，與來自健康患者的血液中收集的外泌體相比，來自GBM患者的血液中收集的外泌體的表達水平更高（圖3F）。Western blotting和免疫熒光圖像顯示，miR-423-3p增加了NHA中的自噬（圖3G，I）。當在miR-423-3p轉(zhuǎn)染的細胞中敲低beclin1時，觀察到了相同的趨勢（圖3H，I），表明了miR-423-3p的自噬誘導效應。鑒于miRNA-423-3p可以誘導自噬，研究了miR-423-3p是否介導GDEs對自噬的影響。與對照相比，提取的GDEs顯著上調(diào)了NHA中的LC3B（圖3J，L），并且使用針對miR-423-3p的抑制RNA消除了NHA中LC3B的上調(diào)（圖3L）。LC3B的免疫熒光染色顯示出了相似的結果（圖3K）。在形態(tài)上，miR-423-3p誘導了自噬體的形成，這被3-MA、beclin1敲低和miRNA抑制劑所抑制（圖3M，N）?？偟膩碚f，miR-423-3p在誘導NHA自噬中發(fā)揮了重要作用。

4）miR-423-3p誘導的H-GDEs自噬促進星形膠質(zhì)細胞的活化

         MiR-423-3p誘導NHA中的自噬，因此，研究了miR-423-3p是否促進了星形細胞的轉(zhuǎn)化。使用miR-423-3p模擬物轉(zhuǎn)染NHA，并使用3-MA或beclin1敲低RNA進行自噬抑制處理。Transwell和EdU測定顯示，miR-423-3p顯著增加了NHA的增殖和遷移，這被自噬抑制所減弱（圖4A，C，E，F）。使用ELISA和Western blotting，我們證實miR-423-3p增加了星形細胞中IL-6和IL-8的分泌（圖4I），并上調(diào)了GFAP的表達（圖4G）。這些結果表明miRNA-423-3p促進了NHA向RA的轉(zhuǎn)變。為了進一步驗證miR-423-3p是否介導GDEs對NHA轉(zhuǎn)化的影響，從常氧條件下過表達miR-423-3p的P3#GBM細胞中提取GDEs來處理NHA。將含有抑制miR-423-3p的miRNA的H-GDEs添加到另一組中。MiR-423-3p顯著增強了轉(zhuǎn)化，而抑制RNA則挽救了H-GDE誘導的NHA轉(zhuǎn)化（圖4B，D-F，H，J）?？偟膩碚f，這些結果表明H-GDEs中的miR-423-3p通過自噬促進了NHA的腫瘤促進轉(zhuǎn)化。

5）H-GDEs中miR-423-3p誘導的RAs在體內(nèi)促進膠質(zhì)瘤的進展

         鑒于膠質(zhì)瘤細胞可以通過外泌體機制誘導NHA向RA的轉(zhuǎn)變，研究了GDEs或miR-423-3p誘導的星形細胞轉(zhuǎn)化是否可以促進膠質(zhì)瘤的進展。將用PBS、N-GDEs和H-GDEs預處理的P3#GBM細胞和星形細胞共植入裸鼠的大腦中，并通過尾靜脈每3天給小鼠注射PBS、N-GDEs和H-GDEs。植入后1周和4周通過生物發(fā)光成像測量的腫瘤體積顯示，與另外兩組小鼠相比，用H-GDE處理的小鼠的腫瘤體積顯著更大（圖5A，B）。隨后，用H-GDE處理的小鼠的生存時間比其他組的小鼠短（圖5C）。H&E和Ki67的免疫組化染色顯示，H-GDE處理組的腫瘤邊界不清且Ki67表達高。還對星形細胞標記物GFAP進行了染色；用H-GDE處理的NHA表現(xiàn)出異形GFAP的高表達，分支數(shù)量明顯增加（圖5D）。此外，LC3B和GFAP的共免疫染色顯示，H-GDE處理顯著增加了NHA中LC3B和異常GFAP的表達（圖5E），表明H-GDE可以在體內(nèi)促進NHA的自噬和轉(zhuǎn)化。在確認了H-GDEs在體內(nèi)促進膠質(zhì)瘤進展的作用后，研究了miR-423-3p對腫瘤進展的影響。將NHA用lenti-miR-control或lenti-ov-miR-423-3p病毒轉(zhuǎn)染，并與P3#GBM細胞一起植入裸鼠中以生成原位異種移植。生物發(fā)光成像顯示，到第4周時，miR-423-3p增加了裸鼠的腫瘤大?。▓D5F，G）。此外，植入小鼠的存活率低于對照組小鼠（圖5H）。一致地，H&E染色顯示miR過表達組中有強烈的腫瘤浸潤（圖5I）。此外，Ki67和GFAP的IHC染色顯示，miR-423-3p誘導的NHA激活促進了膠質(zhì)瘤的增殖率和NHA中異形GFAP的表達（圖5I，J）。共免疫染色進一步表明，與對照小鼠相比，lenti-miR-423-3p表達小鼠的LC3B和異形GFAP水平更高（圖5K）?？偟膩碚f，這些結果表明，來自H-GDEs的miR-423-3p可以促進TME中NHA向RA的轉(zhuǎn)變，并隨后在體內(nèi)促進膠質(zhì)瘤的進展。

6）LAMP3是miR-423-3p的下游靶基因，在NHAs中參與自噬

         為了檢測miR-423-3p在調(diào)節(jié)自噬過程中的下游基因，我們使用了qPCR陣列來探測轉(zhuǎn)染了對照和miR-423-3p模擬物的NHA細胞中與自噬相關的靶基因（圖6A，B）。根據(jù)之前的研究，LAMP3可能是miR-423-3p的下游靶點，其功能與自噬密切相關。通過Western blotting比較了來自U251和P3#GBM細胞的PBS、N-GDEs和H-GDEs處理的NHA細胞中LAMP3的表達。H-GDEs顯著增加了NHA細胞中LAMP3的表達（圖6C）。此外，在轉(zhuǎn)染了miR-423-3p的NHA細胞中，LAMP3的表達增加，當自噬被抑制時，這種趨勢被逆轉(zhuǎn)（圖6D）。這些實驗表明LAMP3可能參與了miR-423-3p對自噬誘導的影響。進一步的pull-down實驗顯示miR-423-3p與LAMP3之間存在直接相互作用，進一步支持了這一推測（圖6E）。

7）15d-PGJ2可以抑制miR-423-3p的活性，抑制NHAs的激活

         為了識別可能抑制miR-423-3p活性的藥物，我們對用miR-control或miR-423-3p處理的NHA進行了轉(zhuǎn)錄組測序，這使我們能夠識別差異表達基因（圖7A，B）。KEGG富集分析顯示，差異表達基因與溶酶體功能、線粒體自噬和代謝途徑相關，所有這些都與自噬有關（圖7C）。此外，GO富集分析突出了外泌體和焦點黏附，有助于隨后形成膠質(zhì)瘤微環(huán)境（圖7D）。我們使用CMap數(shù)據(jù)庫基于差異表達基因預測潛在藥物。預測能通過血腦屏障（BBB）的前三種藥物是GDC-0879、15d-PGJ2和linsitinib（圖7E）。在5 μM濃度下，15d-PGJ2對膠質(zhì)瘤細胞和外泌體均表現(xiàn)出強效抑制作用，這使其效力與GDC-0879和linsitinib區(qū)分開來（圖7F）。結合使用CCK-8測試的IC50（圖7G），這些候選物的分子拓撲極性表面積和分子量，我們選擇了15d-PGJ2進行以下實驗。在NHA中，15d-PGJ2處理導致miR-423-3p誘導的遷移率（圖7H）、GFAP水平（圖7I）和增殖率（圖7J）降低。隨后，觀察到當與用15d-PGJ2預處理的NHA共培養(yǎng)時，P3#GBM細胞的增殖率降低（圖7K），這突出了這種化合物在復雜細胞微環(huán)境中對GBM細胞增長的潛在抗增殖效應。因此，15d-PGJ2被預測為一種有前途的抑制劑，可減少NHA的激活和TME的形成。

結論：

         這項研究揭示了一種正反饋機制，通過這種機制，膠質(zhì)瘤觸發(fā)星形細胞激活，而星形細胞激活反過來又促進膠質(zhì)瘤的惡性程度。此外，膠質(zhì)瘤通過分泌含有miR-423-3p的外泌體，促進了NHA向RA的轉(zhuǎn)變，隨后通過自噬誘導星形細胞反應性。

實驗方法：

         Western blot，Pull down，免疫熒光，ELISA，qRT?PCR，EdU，Transwell，CCK-8，RNA-seq，免疫組化。

參考文獻：

         Tang Z, Xue Z, Liu X, Zhang Y, Zhao J, Liu J, Zhang L, Guo Q, Feng B, Wang J, Zhang D, Li X. Inhibition of hypoxic exosomal miR-423-3p decreases glioma progression by restricting autophagy in astrocytes. Cell Death Dis. 2025 Apr 8;16(1):265. doi: 10.1038/s41419-025-07576-2.