唉 又是被工程化外泌體水凝膠硬控的一天

         以組織收縮力減弱及高糖缺氧環(huán)境下傷口細胞存活受抑為特征的慢性難愈性皮膚創(chuàng)面，是糖尿病治療面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究開發(fā)了一種具有強組織粘附性的自收縮生物活性核殼微凝膠組裝體（SMART-EXO），可加速糖尿病傷口愈合。該敷料憑借豐富的氫鍵和動態(tài)配位鍵實現(xiàn)與損傷組織的強可逆粘附。核殼微凝膠組分與動態(tài)配位鍵共同賦予材料適中剛度、可調(diào)控自收縮性能及互聯(lián)多孔結(jié)構(gòu)。SMART-EXO敷料觸發(fā)的原位自收縮能主動可調(diào)地促進創(chuàng)面收縮，通過激活皮膚機械信號轉(zhuǎn)導，優(yōu)化成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化、膠原合成及血管新生。同步收縮作用還實現(xiàn)了生物活性外泌體的高效負載與按需釋放，促進糖尿病小鼠創(chuàng)面再上皮化和微環(huán)境調(diào)控。RNA測序結(jié)果顯示其同時激活了機械傳感與外泌體調(diào)控的關(guān)鍵信號通路，揭示了力學-生化協(xié)同作用機制。這些發(fā)現(xiàn)表明SMART-EXO為糖尿病創(chuàng)面治療這一復雜難題提供了多功能適應(yīng)性解決方案。本文于2024年9月發(fā)表在《Advanced Materials》IF：27.4期刊上。

圖像摘要

主要實驗結(jié)果如下：

1、具有強組織粘附性的自收縮微凝膠組裝體（SMART）的制備與表征

         首先采用N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）和丙烯酸（AAC）單體，通過改進的沉淀聚合法制備了NIPAM-co-AAC微凝膠（圖1A,B）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示微凝膠具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)（圖1C），動態(tài)光散射（DLS）檢測表明其流體力學直徑為1.83 μm（圖1D）。隨著溫度升高，微凝膠尺寸逐漸減小，當環(huán)境溫度達到約37°C的低臨界溶解溫度（LCST）時，可觀察到明顯的尺寸驟降現(xiàn)象（圖1E；支持信息圖S1）。這一現(xiàn)象歸因于微凝膠聚合物鏈段中同時存在親水性酰胺基團和疏水性異丙基基團：溫度升高時，酰胺基與異丙基之間的鏈內(nèi)氫鍵增強，破壞了酰胺基與水分子間的氫鍵作用，導致疏水相互作用占據(jù)主導，引發(fā)鏈段收縮和水分排出，從而使微凝膠尺寸減小。

         加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺（EDC）后，這些微凝膠進一步自組裝形成自收縮微凝膠組裝體（SMA）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示，單分散微凝膠逐漸聚集形成數(shù)十微米尺度的結(jié)構(gòu)，最終形成大型微凝膠組裝體（圖1F）。48小時后獲得具有多孔結(jié)構(gòu)的圓盤狀組裝體（圖1G），其三維結(jié)構(gòu)由緊密堆積的微凝膠構(gòu)成（圖1H；支持信息圖S2）。該微凝膠還可組裝成心形、三角形等不同形狀（支持信息圖S3），以適應(yīng)不同應(yīng)用場景。

         為構(gòu)建具有強組織粘附性的SMART組裝體，在SMA中引入了聚丙烯酸（PAA）-Ca2?次級網(wǎng)絡(luò)（圖1I）。與SMA表面光滑的微凝膠相比，SMART截面呈現(xiàn)相互連通的孔狀結(jié)構(gòu)（圖1J）。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）顯示，SMA在1731、1779和1810 cm?1處出現(xiàn)特征峰，分別對應(yīng)NHS-酰亞胺的νs（C=O）、NHS-酰亞胺的νs（C=O）和NHS-酯的νs（C=O）（圖1K）。引入PAA網(wǎng)絡(luò)后，SMART在1712 cm?1處的C=O特征吸收峰顯著增強。

         通過頻率掃描流變分析發(fā)現(xiàn)，儲能模量（G'）始終大于損耗模量（G''），符合本體凝膠特性（圖1L）。SMA和SMART均表現(xiàn)出顯著的頻率依賴性，表明體系中存在超分子相互作用。由于PAA-Ca2?網(wǎng)絡(luò)的引入，SMART的G'值明顯高于SMA，且在應(yīng)變掃描測試中屈服點右移（圖1M）。兩種微凝膠組裝體均呈現(xiàn)剪切稀化行為，表現(xiàn)為粘度隨剪切速率增加而線性下降（支持信息圖S4）。交替高低應(yīng)變的時間掃描實驗證實，SMART具有優(yōu)異的剪切稀化和自修復性能，這與切割-愈合實驗現(xiàn)象一致（圖1N,O）。

         傳統(tǒng)均相水凝膠（如PNIPAM溫敏水凝膠）通常響應(yīng)遲緩，需較長時間達到溶脹/收縮平衡（支持信息圖S5）[29,30]。相比之下，核殼結(jié)構(gòu)微凝膠具有致密核層與疏松殼層，賦予材料適中力學性能。微小的尺寸和更大的比表面積使其對環(huán)境變化更敏感，能快速達到溶脹/收縮平衡。因此，SMART具有快速溫度響應(yīng)特性，更有利于調(diào)控創(chuàng)面機械收縮。此外，SMART優(yōu)異的自修復性能源于羧基間氫鍵及羧基-Ca2?動態(tài)配位作用，通過簡單調(diào)節(jié)交聯(lián)點密度即可實現(xiàn)力學性能的可控調(diào)節(jié)。

圖1 組裝的水凝膠導致形成的SMART表現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)的機械性能

2、SMART敷料通過程序化自收縮實現(xiàn)外泌體的自發(fā)裝載與持續(xù)釋放

         基于微凝膠固有的觸發(fā)自收縮特性，SMART敷料在接近正常體溫條件下可發(fā)生瞬時自收縮（圖2A）。在37℃時，敷料立即收縮，其長徑和短徑收縮率（d1/d0、h1/h0）分別達到54.48%和55.12%（圖2B）。微凝膠尺寸顯著影響其自收縮性能：微凝膠尺寸越大，組裝體的自收縮速率越慢（支持信息圖S6）。此外，該微凝膠組裝體能夠響應(yīng)溫度變化實現(xiàn)循環(huán)自收縮（支持信息圖S7）。通過調(diào)節(jié)羧基-Ca2?交聯(lián)點密度，可精確控制收縮程度。隨著鈣離子濃度升高，SMARThc敷料在截面EDS能譜中顯示出更強的Ca Kα1信號，且其體積收縮率較SMART明顯降低（圖2C-E；支持信息表S1）。

         考慮到間充質(zhì)干細胞外泌體具有促進皮膚修復的作用，作者提取hMSCs分泌的外泌體（支持信息圖S8）。這些外泌體尺寸分布在30-200 nm范圍內(nèi)（圖2F）。通過檢測外泌體標志物CD81的表達，同時確認外泌體組分中不含細胞特異性蛋白β-actin（圖3G），驗證了外泌體的純度。透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）分別觀察到典型的杯狀囊泡結(jié)構(gòu)（圖2H和2I），證實外泌體成功分離。

         當環(huán)境溫度低于SMART的低臨界溶解溫度（LCST）時，微凝膠中酰胺基團與水分子間形成大量氫鍵。這種相互作用促使SMART發(fā)生水合作用并隨之體積膨脹，從而促進外泌體向水凝膠內(nèi)部的擴散和有效裝載（圖2J）。當溫度超過LCST后，氫鍵網(wǎng)絡(luò)的破壞引發(fā)聚合物鏈段收縮及SMART整體體積減小，進而實現(xiàn)所載外泌體的釋放。

         共聚焦顯微鏡（CLSM）圖像顯示，熒光標記的外泌體隨時間推移在SMART中實現(xiàn)了均勻分布和成功裝載（圖2L）。在37℃條件下，雖然前3天呈現(xiàn)持續(xù)釋放特征，但外泌體可在SMART中保留長達14天，且最終釋放率超過90%（圖2K,L；支持信息圖S9）。值得注意的是，負載外泌體的SMART（SMART-EXO）與空白組表現(xiàn)出相似的力學行為（圖2M,N），且其粘度隨剪切速率增加呈現(xiàn)近似線性下降趨勢（圖2O）。

         簡言之，本研究開發(fā)的SMART系統(tǒng)通過其固有的自收縮特性實現(xiàn)了干細胞外泌體的高效裝載與持續(xù)釋放。更重要的是，外泌體的引入并未影響SMART的整體力學性能。

圖2 SMART使外泌體自發(fā)加載和持續(xù)釋放以響應(yīng)溫度變化

3、SMART-EXO敷料通過優(yōu)異粘附性與原位觸發(fā)自收縮促進創(chuàng)面閉合

         為實現(xiàn)通過機械刺激促進傷口愈合的應(yīng)用目標，SMART-EXO敷料需具備足夠的組織粘附性。當接觸濕潤損傷組織時，敷料中的羧基基團能與皮膚組織氨基快速形成氫鍵，10秒內(nèi)即可建立穩(wěn)定粘附（圖3A）。該敷料在扭曲、彎曲或沖洗條件下仍能牢固粘附豬皮及心臟組織（圖3B），對雞皮樣本在PBS浸泡12小時后仍保持優(yōu)異粘附強度（圖3C）。特別值得注意的是，SMART-EXO能有效粘附于充滿模擬腸液（SIF）的損傷豬腸（直徑5mm圓形創(chuàng)面）外表面，并通過原位觸發(fā)自收縮實現(xiàn)創(chuàng)面密封（圖3D）。

         定量測試顯示，SMART-EXO敷料在豬皮上的剪切強度和創(chuàng)面閉合強度分別超過56 kPa和1.5 N，平均界面韌性達81 J m?2（圖3E）。而噴涂生物相容性碳酸氫鈉溶液后，界面韌性可降至11.94 J m?2，實現(xiàn)敷料無創(chuàng)移除（圖3F）。得益于近體溫觸發(fā)的瞬時自收縮特性，該敷料能主動縮小創(chuàng)面尺寸（圖3G）。體外實驗表明，在糖尿病小鼠離體皮膚8mm創(chuàng)面模型上，37℃時敷料可使創(chuàng)面長徑和短徑分別收縮至55.18%和56.58%（圖3H）。通過調(diào)節(jié)羧基-Ca2?交聯(lián)密度，可編程控制收縮程度（支持信息圖S11）。例如高鈣濃度的SMARThc-EXO可使創(chuàng)面尺寸更溫和地縮小至77.1%和74.3%（圖3H），這種精確調(diào)控能力有望抑制瘢痕過度形成。

         相較于商業(yè)敷料產(chǎn)品，SMART-EXO展現(xiàn)出更優(yōu)異的粘附性能（圖3E）[18,31]。其獨特的觸發(fā)式脫附特性避免了傳統(tǒng)敷料移除時的二次損傷，特別適用于需要頻繁更換敷料的慢性糖尿病創(chuàng)面[32,33]。與靜態(tài)力學特性的塊狀水凝膠敷料不同，SMART-EXO基于體積相變溫度（VPT）的瞬時響應(yīng)，能有效誘導濕潤損傷組織的機械收縮。通過簡單調(diào)節(jié)交聯(lián)點密度，即可實現(xiàn)對創(chuàng)面機械收縮程度的程序化編輯。

圖3 SMART-EXO具有優(yōu)異的粘附性，可觸發(fā)脫離，可編程的皮膚傷口閉合自收縮

4、SMART-EXO敷料通過力學-生化協(xié)同作用加速糖尿病創(chuàng)面愈合

         首先評估SMART和SMART-EXO敷料的細胞相容性和血液相容性。與3T3成纖維細胞共培養(yǎng)2天后，活/死染色顯示絕大多數(shù)細胞保持活性（支持信息圖S12A-C）。不同濃度敷料浸提液培養(yǎng)的細胞存活率均超過90%（支持信息圖S12D,E），溶血實驗顯示兩組敷料溶血率均低于6%（支持信息圖S12F），證實其具有良好的生物相容性。

         為探究機械收縮與外泌體的協(xié)同治療效應(yīng)，在db/db糖尿病小鼠全層皮膚缺損模型上設(shè)置了四組處理：SMART-EXO組（含外泌體的敷料）、SMART組（空白敷料）、EXO組（單純外泌體懸液）和空白對照組（圖4A）。結(jié)果顯示，SMART-EXO組創(chuàng)面閉合速度最快，第16天時創(chuàng)面面積僅為初始的8.3%±3.20%（圖4B,C）。SMART組（37.00%±5.65%）和EXO組（46.16%±13.59%）的促愈合效果均顯著優(yōu)于對照組（68.35%±11.38%），證實機械刺激與生化因子具有協(xié)同促進作用。組織學分析顯示：第8天時SMART-EXO組表皮厚度達145μm，顯著高于其他組（SMART組107μm，EXO組110μm，對照組27μm）（圖4D,E）；而到第16天時其表皮厚度變?yōu)樽畋。▓D4F），表明愈合過程已進入重塑期。Masson染色顯示SMART-EXO組膠原沉積量更多且排列更有序（圖4I；支持信息圖S13）。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)該組CD31（血管標志物）和α-SMA+（肌成纖維細胞標志物）表達量最高（圖4G,H,J,K），提示敷料的機械收縮通過調(diào)控創(chuàng)面應(yīng)力促進血管新生和肌成纖維細胞重建[34]。

         值得注意的是，SMART-EXO在II型糖尿病小鼠模型中的治療效果優(yōu)于既往報道的多種干預措施[16,18,35-39]。表皮厚度動態(tài)變化表明該敷料能有效推動創(chuàng)面從炎癥期、增殖期向重塑期轉(zhuǎn)化[40]。在db/db小鼠中，成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化異常會導致創(chuàng)面收縮功能障礙[41,42]，而本研究證實SMART-EXO能通過力學-生化雙重作用重建這一轉(zhuǎn)化過程。

         為避免過度機械刺激的不利影響，臨床應(yīng)用時需通過精確調(diào)控SMART-EXO的自收縮性能來施加適度機械應(yīng)力，并定期更換敷料。糖尿病小鼠模型實驗結(jié)果證實，本研究開發(fā)的SMART-EXO敷料能安全有效地加速創(chuàng)面愈合。

圖4 SMART-EXO敷料加速糖尿病小鼠傷口愈合

5、SMART-EXO敷料通過激活機械信號轉(zhuǎn)導促進血管新生與上皮再生加速糖尿病創(chuàng)面愈合

         為闡明SMART-EXO調(diào)控糖尿病創(chuàng)面修復的分子機制，首先評估了其對關(guān)鍵信號通路的影響。與SMART組相比，第16天時SMART-EXO組創(chuàng)面組織中磷酸化PI3K（p-PI3K）、RAF（p-RAF）、AKT（p-AKT）和Erk1/2（p-Erk1/2）表達顯著上調(diào)（圖5A,B；支持信息圖S14），表明外泌體可能通過激活PI3K/AKT和MAPK/Erk通路發(fā)揮作用（圖5C）。

         通過第16天創(chuàng)面組織的RNA測序分析（支持信息圖S15,S16），主成分分析（PCA）顯示對照組、SMART組和SMART-EXO組呈現(xiàn)明顯不同的轉(zhuǎn)錄組特征（圖5D）。差異基因分析發(fā)現(xiàn)：SMART組與對照組相比有3609個差異基因（2138個上調(diào)）；SMART-EXO組與對照組相比有1888個差異基因（1173個上調(diào)）；SMART-EXO組與SMART組相比有811個差異基因（410個上調(diào)）（圖5E-G）。Reactome通路富集分析顯示，相較于SMART組，SMART-EXO組顯著富集于PI3K/AKT、MAPK和HIF-1等通路（圖5H），證實外泌體通過促進細胞增殖、血管生成及炎癥調(diào)控加速愈合。與對照組相比，SMART-EXO還特異性激活TGF-β/Smad和Hippo等機械信號轉(zhuǎn)導通路（圖5I），提示敷料的機械收縮力通過促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化、膠原形成及組織發(fā)育發(fā)揮作用。

         GO分析進一步表明：相較于SMART組，SMART-EXO組差異基因主要富集于細胞增殖、遷移及血管重塑等生物學過程（圖5J）；與對照組相比，則顯著富集于肌肉收縮調(diào)控、肌動蛋白骨架重組、平滑肌發(fā)育、上皮細胞遷移、血管內(nèi)皮遷移及血管生成等功能（圖5K）。這些發(fā)現(xiàn)共同證明，SMART-EXO敷料通過力學刺激與生化因子的協(xié)同作用，從細胞遷移、增殖、血管新生和上皮再生等多維度促進糖尿病創(chuàng)面修復（圖6）。

圖5 SMART-EXO通過促進細胞遷移、增殖、血管生成和再上皮化來加速糖尿病皮膚傷口愈合

 實驗方法：

         水凝膠的制備，外泌體分離和鑒定，傅里葉變換紅外光譜，流變學，機械特性，糖尿病小鼠傷口愈合修復動物實驗，生物相容性，病理和免疫熒光染色，WB，RT-qPCR

參考文獻：

         Xie Q, Yan C, Liu G, Bian L, Zhang K. In Situ Triggered Self-Contraction Bioactive Microgel Assembly Accelerates Diabetic Skin Wound Healing by Activating Mechanotransduction and Biochemical Pathway. Adv Mater. 2024 Sep;36(38):e2406434. doi: 10.1002/adma.202406434. Epub 2024 Jul 23. PMID: 39039968.