年輕成纖維細(xì)胞來源的遷移體-老年皮膚創(chuàng)面愈合治療的手段

         細(xì)胞衰老所引發(fā)的細(xì)胞間通訊改變是皮膚衰老的一個重要因素。遷移體作為一種新發(fā)現(xiàn)的囊泡狀細(xì)胞器，能夠高效地參與細(xì)胞間通訊；然而，細(xì)胞衰老與遷移體之間的關(guān)系目前尚未見報道。單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)分析顯示，在皮膚衰老過程中，成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄變異性，且成纖維細(xì)胞的衰老程度與遷移體相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的多重免疫組化結(jié)果表明，年輕小鼠皮膚中的遷移體數(shù)量多于老年小鼠皮膚。透射電子顯微鏡觀察顯示，年輕個體皮膚中存在大量遷移體。體外實(shí)驗(yàn)表明，與衰老的成纖維細(xì)胞相比，年輕成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的遷移體數(shù)量顯著更多。從年輕成纖維細(xì)胞中純化的遷移體能夠降低HaCaT細(xì)胞中衰老相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用自然衰老小鼠的傷口愈合模型，我們觀察到來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體不僅能夠加速傷口愈合，還能降低皮膚中衰老相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)?？傊?，在皮膚衰老的進(jìn)程中，遷移體的形成能力會降低，而源自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體能夠使衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞恢復(fù)年輕態(tài)，并促進(jìn)老年皮膚的傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)為緩解皮膚衰老以及提升老年皮膚傷口愈合能力提供了新的思路。本文于2025年3月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.6）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）在皮膚衰老過程中成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄變異性

         為了描述皮膚衰老過程中各種細(xì)胞類型比例和功能的動態(tài)變化，我們分析了來自人類樣本的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)。我們對包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞在內(nèi)的11種不同的皮膚細(xì)胞類型進(jìn)行了注釋（圖1A）。為了進(jìn)一步探究人類皮膚衰老背后的分子變化，我們將與衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs）與來自GenAge數(shù)據(jù)庫的衰老和長壽相關(guān)基因進(jìn)行了全面的比較分析。結(jié)果顯示，在皮膚衰老過程中，成纖維細(xì)胞在所有已鑒定的皮膚細(xì)胞類型中表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄變異性（圖1B和C）。因此，在后續(xù)的分析中，我們將重點(diǎn)放在成纖維細(xì)胞上。

2）ScRNA-seq顯示遷移體的形成與細(xì)胞衰老呈負(fù)相關(guān)

         TSPAN4已被確定為遷移體形成的關(guān)鍵促進(jìn)因子，且TSPAN4的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了遷移體的形成能力。為了探究遷移體與衰老之間的關(guān)系，我們從GSE130973中針對TSPAN4基因進(jìn)行了富集分析。有趣的是，結(jié)果顯示TSPAN4也主要在成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖2A）。我們提取了成纖維細(xì)胞群（圖2B），并對成纖維細(xì)胞進(jìn)行了獨(dú)立分析，結(jié)果表明，與遷移體相關(guān)的標(biāo)記物TSPAN4、TSPAN9、CPQ、EOGT、PIGK和NDST1與GenAge數(shù)據(jù)庫中的衰老相關(guān)基因呈負(fù)相關(guān)（圖2C）。這些結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞的衰老過程可能會影響遷移體的形成。

3）成纖維細(xì)胞衰老可減少遷移體的形成

         為了進(jìn)一步驗(yàn)證成纖維細(xì)胞中遷移體的形成與衰老之間的關(guān)系，我們使用來自三只年輕（8周齡）和三只老年（64周齡）C57BL/6J小鼠的皮膚組織進(jìn)行了多重免疫組化（mIHC）分析。我們使用波形蛋白（Vimentin）標(biāo)記成纖維細(xì)胞，并通過TSPAN4與WGA的共定位來指示遷移體。年輕小鼠的皮膚顯示出波形蛋白、TSPAN4和WGA更高的共定位比例，這表明年輕成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的遷移體更多（圖3A）。為了進(jìn)一步確認(rèn)皮膚中遷移體的存在，我們使用透射電子顯微鏡分析了年輕個體的皮膚。我們在真皮乳頭層中觀察到了顯著的遷移體樣結(jié)構(gòu)積累（黃色箭頭）（圖3B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證成纖維細(xì)胞的衰老過程可能會抑制遷移體的形成，我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。非衰老的成纖維細(xì)胞比衰老的成纖維細(xì)胞能更顯著地形成遷移體（圖3C和E），這一結(jié)果通過掃描電子顯微鏡得到了證實(shí)（圖3D和F）。此外，與遷移體相關(guān)的標(biāo)志物包括EOGT、PIGK和TSPAN4在非衰老的成纖維細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3G）。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了我們的假設(shè)，即年輕的成纖維細(xì)胞比衰老的成纖維細(xì)胞能更有效地產(chǎn)生遷移體。

4）年輕成纖維細(xì)胞遷移體緩解HaCaT細(xì)胞衰老

         考慮到遷移體主要沉積在表皮-真皮交界處附近，且成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的相互作用在皮膚衰老過程中起著關(guān)鍵作用，我們進(jìn)一步研究了成纖維細(xì)胞來源的遷移體對上皮細(xì)胞衰老的影響。為此，我們首先從年輕人中提取了成纖維細(xì)胞，并通過波形蛋白免疫熒光染色進(jìn)行了鑒定。隨后，我們通過密度梯度離心法純化了來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體（圖4A）。純化后的遷移體呈現(xiàn)出典型的石榴狀結(jié)構(gòu)，具有可見的相互連接的收縮纖維結(jié)構(gòu)，直徑約為0.5–3微米（圖4B）。在純化的樣本中，與遷移體相關(guān)的標(biāo)志物高表達(dá)（圖4C）。為了探究遷移體是否能被衰老的HaCaT細(xì)胞內(nèi)化，我們將WGA標(biāo)記的遷移體引入衰老的HaCaT細(xì)胞中。結(jié)果顯示，遷移體在細(xì)胞內(nèi)分散分布（圖4D）。隨后，我們用不同濃度的成纖維細(xì)胞來源的遷移體（2.5、5、7.5和10 μg/ml）處理衰老的HaCaT細(xì)胞。來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體降低了SA-β-gal陽性細(xì)胞的比例（圖4E和G）。Western blot顯示，遷移體顯著降低了H?O?誘導(dǎo)的p16和p21表達(dá)升高（圖4F、H和I）。根據(jù)這些結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)10 μg/ml的濃度效果最佳，因此在后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用了這一濃度。

5）年輕的成纖維細(xì)胞衍生的遷移體促進(jìn)衰老的HaCaT細(xì)胞功能

         我們進(jìn)一步研究了來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體對衰老HaCaT細(xì)胞功能的影響。Ki-67免疫熒光染色結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞來源的遷移體增強(qiáng)了衰老HaCaT細(xì)胞的增殖活性（圖5A和B）。劃痕實(shí)驗(yàn)（圖5C和F）和transwell遷移實(shí)驗(yàn)（圖5D和G）表明，來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體顯著提高了衰老HaCaT細(xì)胞的遷移能力?？紤]到活性氧（ROS）與衰老之間的關(guān)聯(lián)，我們檢測了ROS水平。結(jié)果顯示，遷移體降低了衰老HaCaT細(xì)胞中升高的ROS水平（圖5E和H）。這些結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞來源的遷移體能夠緩解HaCaT細(xì)胞的衰老。

6）年輕成纖維細(xì)胞衍生的遷移體促進(jìn)衰老小鼠皮膚傷口愈合

         考慮到衰老會損害受損組織的再生能力以及來自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體對HaCaT細(xì)胞的影響，我們進(jìn)一步研究了這些遷移體是否也能促進(jìn)老年皮膚中的傷口愈合。我們建立了一個全層皮膚傷口模型。小鼠被隨機(jī)分為四組：年輕小鼠組（Y）、老年小鼠對照組（AC）、老年小鼠注射磷酸鹽緩沖液（PBS）組（AP）和老年小鼠注射遷移體組（AM）。AP和AM組在傷口周圍進(jìn)行了皮下注射，每處注射25 μg（共四處）。我們在第0、3、5、7和12天對模型進(jìn)行拍照和記錄，并在第12天采集樣本（圖6A）。觀察結(jié)果顯示，年輕小鼠組的愈合速度顯著快于AC和AP組，這凸顯了衰老對傷口愈合的不利影響。AP組和AC組之間沒有顯著差異，但AM組的愈合速度顯著快于AC和AP組。有趣的是，在最初的7天內(nèi)，AM組的愈合能力甚至優(yōu)于年輕小鼠組，但隨后被年輕小鼠組超越。這種現(xiàn)象可能是由于AM組在受傷7天后遷移體被耗盡所致（圖6B、C和D）。HE染色顯示，AC和AP組的再上皮化過程雜亂無章，而AM組則表現(xiàn)出更優(yōu)越的再上皮化（圖6E）。Masson染色表明，與AC和AP組相比，AM組的真皮厚度增加，膠原纖維形成更多（圖6F）。

7）年輕成纖維細(xì)胞來源的遷移體減少衰老細(xì)胞和SASP

         先前的研究已報道，通過靶向細(xì)胞衰老來增強(qiáng)傷口愈合主要涉及減少衰老細(xì)胞和衰老相關(guān)分泌表型（SASP）。因此，我們通過免疫組化和Western blot探討了遷移體注射對衰老細(xì)胞和SASP的影響。免疫組化分析顯示，與AC和AP組相比，AM組和年輕小鼠組（Y）的p21蛋白水平顯著降低（圖7A和D）。同樣，與AC和AP組相比，AM組和Y組的SA-β-gal蛋白水平也顯著下調(diào)（圖7B和E）。相反，與AC和AP組相比，AM組和Y組的Ki-67蛋白水平顯著上調(diào)（圖7C和F）。這些結(jié)果表明，注射遷移體顯著減少了衰老細(xì)胞的數(shù)量。我們還檢測了促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和MMP-14。與AC和AP組相比，AM組和Y組的IL-1β、IL-6和MMP-14蛋白水平顯著下調(diào)（圖7G），這表明遷移體可以緩解SASP。

結(jié)論：

         本研究揭示了在成纖維細(xì)胞衰老和皮膚衰老過程中，遷移體的形成能力顯著下降。此外，源自年輕成纖維細(xì)胞的遷移體能夠使衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞恢復(fù)活力，并促進(jìn)老年皮膚的傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)為針對皮膚衰老的新療法開發(fā)提供了新穎的見解和方向。

實(shí)驗(yàn)方法：

         單細(xì)胞測序，遷移體分離，Western blotting，免疫熒光，Transwell，劃痕實(shí)驗(yàn)，免疫組化。

參考文獻(xiàn)：

         Tu H, Shi Y, Guo Y, Zou Z, He Y, Zhou J, He S, Sa G. Young fibroblast-derived migrasomes alleviate keratinocyte senescence and enhance wound healing in aged skin. J Nanobiotechnology. 2025 Mar 11;23(1):200. doi: 10.1186/s12951-025-03293-2.