糖尿病血管病變新機制：AGE誘導的巨噬細胞外泌體如何引發(fā)內(nèi)皮功能障礙

         糖尿病患者常伴有內(nèi)皮功能障礙，這是糖尿病心血管并發(fā)癥的關(guān)鍵因素之一。高血糖、血脂異常等代謝紊亂與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制密切相關(guān)。糖尿病患者長期暴露于高血糖環(huán)境，會形成穩(wěn)定的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE），這些物質(zhì)可與單核細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，放大促炎效應，導致內(nèi)皮細胞激活、黏附分子分泌增加和內(nèi)皮完整性受損。巨噬細胞外泌體是細胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，參與多種心血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，包括糖尿病心血管并發(fā)癥。研究表明，糖尿病患者血液中外泌體數(shù)量顯著增加，且糖尿病小鼠血液中外泌體可損害主動脈舒張功能，但關(guān)于糖尿病環(huán)境下巨噬細胞來源外泌體對內(nèi)皮細胞的調(diào)控機制研究較少。文章假設(shè)在糖尿病環(huán)境下，AGE可能誘導巨噬細胞釋放更多外泌體，這些外泌體作為載體，將生物學信息傳遞給內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)其功能。該研究于2025年4月發(fā)表于《Cardiovascular Diabetology》，IF=8.5。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1. 巨噬細胞來源的外泌體的鑒定 

         研究者從用AGE或BSA處理的巨噬細胞培養(yǎng)上清中分離出外泌體，并通過透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）和西方印跡法進行鑒定。TEM顯示這些顆粒具有典型的外泌體杯狀形態(tài)（圖1A）。NTA顯示，AGE-Exos和BSA-Exos的粒徑分布分別為160.24 ± 1.53 nm和143.81 ± 5.95 nm（圖1B）。西方印跡法確認這些顆粒高表達CD9、ALIX和CD63，而低表達鈣網(wǎng)蛋白和GAPDH，與巨噬細胞相比差異顯著（圖1C）。此外，NTA結(jié)果表明，與BSA對照相比，AGE處理顯著增加了巨噬細胞釋放的外泌體數(shù)量（圖1D）。

圖1 巨噬細胞來源的外泌體的鑒定 

2. AGE-Exos損傷內(nèi)皮細胞功能 

         為了評估AGE-Exos對內(nèi)皮細胞（ECs）的影響，研究者觀察到PKH-26標記的AGE-Exos被內(nèi)皮細胞攝取，并在細胞核和核周區(qū)域積累（圖2A）。研究者隨后通過CCK-8、EdU、Transwell和血管形成實驗評估了AGE-Exos對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的影響。CCK-8結(jié)果顯示，AGE-Exos和BSA-Exos在0.5至2.0 × 10? Exos/mL的濃度范圍內(nèi)均未影響HUVECs的活性（圖2B）。EdU染色表明，BSA-Exos對HUVECs的增殖無顯著影響，而AGE-Exos顯著抑制了其增殖（圖2C）。Transwell實驗顯示，與PBS組和BSA-Exos組相比，AGE-Exos組遷移到下室的細胞數(shù)量減少（圖2D）。與PBS和BSA-Exos組相比，AGE-Exos組的總管長度顯著縮短（圖2E）。這些結(jié)果表明，AGE-Exos損傷了ECs的功能。

圖2 AGE-Exos損傷內(nèi)皮細胞功能 

3. AGE-Exos增強單核細胞黏附并增加內(nèi)皮細胞黏附分子表達 

         單核細胞黏附到血管內(nèi)皮是動脈粥樣硬化的一個關(guān)鍵步驟。與PBS和BSA-Exos組相比，AGE-Exos組黏附到HUVECs的單核細胞數(shù)量顯著增加（圖3A）。如圖3B所示，與BSA-Exos相比，AGE-Exos顯著增加了VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的蛋白表達，同時降低了eNOS的磷酸化程度。ELISA結(jié)果顯示，AGE-Exos顯著增加了HUVECs上清中sICAM-1、sVCAM-1和IL-6的水平，而BSA-Exos則無此效應（圖3C）。

圖3 AGE-Exos增強單核細胞黏附并增加內(nèi)皮細胞黏附分子表達 

4. miR-22-5p在AGE-Exos中富集并被傳遞至內(nèi)皮細胞 

         為了識別糖尿病背景下可能參與內(nèi)皮損傷的miRNA，研究者使用miRNA芯片分析了AGE-Exos和BSA-Exos的miRNA表達譜。分析結(jié)果顯示，與BSA-Exos相比，AGE-Exos中有9個miRNA上調(diào)，7個miRNA下調(diào)（圖4A、B）。其中，miR-22-5p在AGE-Exos中最為豐富，并且已知其參與心血管疾病的發(fā)生。鑒于其顯著性和相關(guān)性，研究者進一步研究了miR-22-5p。隨后的qPCR結(jié)果顯示，AGE處理并未改變巨噬細胞中miR-22-5p的水平，但顯著增加了AGE-Exos中的miR-22-5p水平（圖4C）。 

         為了確認AGE-Exos可以將miR-22-5p傳遞至HUVECs，研究者使用Cy3標記的miR-22-5p轉(zhuǎn)染巨噬細胞，收集外泌體，并與HUVECs共培養(yǎng)。熒光顯微鏡顯示，Cy3-miR-22-5p的紅色熒光在HUVECs的細胞核和核周區(qū)域積累（圖4D）。此外，qPCR分析顯示，與BSA-Exos相比，AGE-Exos處理的HUVECs中miR-22-5p水平增加（圖4E）。這些結(jié)果表明，miR-22-5p在AGE-Exos中顯著上調(diào)，并能高效傳遞至HUVECs。

圖4 miR-22-5p在AGE-Exos中富集并被傳遞至內(nèi)皮細胞 

5. miR-22-5p介導內(nèi)皮細胞功能障礙 

         為了進一步探討miR-22-5p在HUVECs中的作用，研究者使用慢病毒介導的感染過表達miR-22-5p。熒光顯微鏡確認超過90%的HUVECs成功表達了GFP，qPCR顯示慢病毒過表達組中miR-22-5p水平顯著增加（圖5A）。 

         研究者隨后研究了miR-22-5p過表達對ECs功能的影響。CCK-8結(jié)果顯示，Blank、LV-NC和LV-miR-22-5p組之間的細胞活性無顯著差異，表明miR-22-5p過表達不影響細胞活性（圖5B）。與Blank和LV-NC組相比，LV-miR-22-5p組VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的水平顯著升高，而eNOS的磷酸化程度降低，表明miR-22-5p過表達促進了ECs的炎癥激活（圖5C）。EdU染色顯示，與Blank和LV-NC組相比，LV-miR-22-5p組HUVECs的增殖率顯著降低（圖5D）。Transwell實驗顯示，與Blank和LV-NC組相比，LV-miR-22-5p組遷移細胞數(shù)量顯著減少（圖5E）。血管形成實驗表明，與Blank和LV-NC組相比，LV-miR-22-5p組的總管長度顯著縮短（圖5F）。這些結(jié)果表明，miR-22-5p參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能障礙和激活。

圖5 miR-22-5p介導內(nèi)皮細胞功能障礙 

6. FOXP1是miR-22-5p的新靶點 

         生物信息學工具（如miRWalk、TargetScan和miRPathDB）識別出叉頭框蛋白P1（FOXP1）是miR-22-5p的潛在靶基因，因為FOXP1 mRNA的3'-非翻譯區(qū)存在特異性結(jié)合位點（圖6A）。為了驗證FOXP1是miR-22-5p的靶點，研究者進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐⒁吧停?span>FOXP1-WT）或突變型（FOXP1-Mut）質(zhì)粒與miR-22-5p模擬物或NC模擬物共轉(zhuǎn)染。與FOXP1-Mut共轉(zhuǎn)染時，miR-22-5p模擬物未產(chǎn)生影響，而與FOXP1-WT共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性降低，證實了結(jié)合相互作用（圖6B）。 

         為了進一步研究miR-22-5p對FOXP1的調(diào)控作用，研究者利用慢病毒過表達miR-22-5p。qPCR（圖6C）和西方印跡法（圖6D）分析顯示，與LV-NC組相比，miR-22-5p過表達組FOXP1的mRNA和蛋白水平顯著降低。這些結(jié)果證實miR-22-5p靶向并負向調(diào)控FOXP1的表達。

圖6 FOXP1是miR-22-5p的新靶點   

7. miR-22-5p抑制劑部分緩解AGE-Exos誘導的內(nèi)皮細胞損傷 

         為了評估抑制miR-22-5p是否可以預防或緩解AGE-Exos誘導的內(nèi)皮損傷，研究者使用抗miR-22-5p抑制劑降低HUVECs中miR-22-5p的水平。EdU實驗顯示，與抑制劑NC + AGE-Exos組（10.34 ± 0.66%）相比，miR-22-5p抑制劑 + AGE-Exos組（13.95 ± 0.42%）的EdU陽性細胞百分比顯著增加（圖7A）。此外，miR-22-5p抑制劑消除了AGE-Exos誘導的ECs遷移受損（圖7B）。西方印跡法顯示，抗miR-22-5p抑制劑有效消除了AGE-Exos誘導的VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的上調(diào)，并部分恢復了FOXP1的表達（圖7C）。這些結(jié)果支持AGE-Exos的效應部分由miR-22-5p介導，抑制miR-22-5p可以部分緩解AGE-Exos誘導的內(nèi)皮損傷的觀點。

圖7 miR-22-5p抑制劑部分緩解AGE-Exos誘導的內(nèi)皮細胞損傷 

8. FOXP1過表達預防miR-22-5p誘導的內(nèi)皮細胞炎癥和功能障礙 

         研究者進一步研究了FOXP1在miR-22-5p誘導的內(nèi)皮細胞炎癥和功能障礙中的作用。與NC模擬物相比，hsa-miR-22-5p模擬物增加了VCAM-1、ICAM-1、MCP-1和p-NFκB的水平，同時降低了p-eNOS和FOXP1的表達。值得注意的是，FOXP1的過表達（LV-FOXP1）部分消除了這種現(xiàn)象（圖8A）。此外，FOXP1過表達顯著減輕了hsa-miR-22-5p模擬物對ECs增殖（圖8B）和血管形成（圖8C）的抑制作用。這些觀察結(jié)果表明，FOXP1是miR-22-5p的下游靶點，對其功能至關(guān)重要。FOXP1過表達可保護內(nèi)皮細胞免受miR-22-5p誘導的炎癥和功能障礙。

圖8 FOXP1過表達預防miR-22-5p誘導的內(nèi)皮細胞炎癥和功能障礙 

9. 巨噬細胞Rab27a抑制減輕AGE刺激的巨噬細胞外泌體引起的內(nèi)皮細胞炎癥 

         外泌體的合成和分泌涉及多個基因的調(diào)控，研究者通過西方印跡法檢測了不同處理后單核巨噬細胞中相關(guān)蛋白的表達。如圖9A所示，與BSA對照相比，AGE處理顯著增加了RAGE和Rab27a蛋白水平。Rab27a是Rab GTP酶家族的成員，與外泌體的生物合成和分泌密切相關(guān)。為了評估Rab27a與AGE-Exos誘導的ECs炎癥之間的關(guān)系，研究者使用siRNA抑制巨噬細胞Rab27a的表達。如圖9B所示，si-Rab27a顯著降低了Rab27a蛋白水平，隨后用于后續(xù)實驗。用si-Rab27a預處理THP-1細胞并用AGE刺激，收集的外泌體與HUVECs共培養(yǎng)。與BSA-si-NC-Exos相比，AGE-si-NC-Exos增加了HUVECs中VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的表達，同時降低了p-eNOS和FOXP1的表達。當巨噬細胞Rab27a被沉默時，這種效應被逆轉(zhuǎn)（圖9C）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明Rab27a有助于巨噬細胞來源外泌體對ECs的有害效應。

圖9 巨噬細胞Rab27a抑制減輕AGE刺激的巨噬細胞外泌體引起的內(nèi)皮細胞炎癥 

10. 抑制外泌體釋放減少T2DM模型小鼠的內(nèi)皮炎癥 

         為了進一步研究外泌體在糖尿病血管疾病中的作用，研究者使用TALEN基因編輯技術(shù)生成了Rab27a基因敲除小鼠，并建立了T2DM小鼠模型（圖10A、B）。免疫熒光分析顯示，與非T2DM小鼠相比，T2DM小鼠主動脈中CD63陽性熒光斑點數(shù)量增加，CD31熒光沿內(nèi)皮邊緣的連續(xù)性降低。值得注意的是，Rab27a基因敲除改變了這些參數(shù)，減少了Rab27a-/--STZ小鼠主動脈中CD63陽性熒光斑點的數(shù)量，并增加了CD31熒光的連續(xù)性（圖10C、D）。免疫組化進一步證實，與非T2DM小鼠相比，T2DM小鼠主動脈中VCAM-1和ICAM-1的表達增加，但在Rab27a-/--STZ小鼠中顯著減少（圖10E）。西方印跡法顯示，與非T2DM小鼠相比，T2DM小鼠主動脈中Rab27a表達增加，FOXP1表達降低，而在Rab27a-/--STZ小鼠中FOXP1水平恢復（圖10F）。這些結(jié)果表明，Rab27a基因敲除減少了外泌體的釋放，減輕了T2DM模型小鼠的內(nèi)皮炎癥。

圖10 抑制外泌體釋放減少T2DM模型小鼠的內(nèi)皮炎癥 

結(jié)論

         在糖尿病環(huán)境下，AGE誘導的巨噬細胞外泌體釋放可能部分依賴于Rab27a運輸，通過敲除Rab27a可減少T2DM模型小鼠主動脈中外泌體的積累，減輕內(nèi)皮不連續(xù)性，下調(diào)VCAM-1和ICAM-1表達，上調(diào)FOXP1表達，表明靶向miR-22-5p或Rab27a有望成為預防和治療糖尿病血管病變的新策略。

實驗方法

         2型糖尿病動物模型建立、細胞培養(yǎng)、巨噬細胞外泌體提取、透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、CCK-8實驗、EdU實驗、Transwell實驗、血管形成實驗、單核細胞黏附實驗、ELISA、Western blotting、miRNA測序和生物信息學分析、RT-qPCR、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、免疫熒光、免疫組化。

參考文獻

         Ji Y, Chen H, Pang L, Chen C, Wang S, Chen J, Fang L, Liu B, Cheng Y, Liu S, Zhong Y. AGE induced macrophage-derived exosomes induce endothelial dysfunction in diabetes via miR-22-5p/FOXP1. Cardiovasc Diabetol. 2025 Apr 9;24(1):158. doi: 10.1186/s12933-025-02715-7. PMID: 40205587.