Serpina3k 乳酸化可預(yù)防心臟缺血再灌注損傷

   乳酸在缺血再灌注損傷期間產(chǎn)生，已知可促進(jìn)蛋白質(zhì)的乳酸化，其作用存在爭(zhēng)議。通過(guò)質(zhì)譜分析小鼠心肌在缺血再灌注損傷期間的乳酸化組和蛋白質(zhì)組，作者發(fā)現(xiàn)Serpina3k蛋白表達(dá)及其在賴氨酸351位點(diǎn)的乳酸化在再灌注時(shí)均增加。Serpina3k及其人類同源物SERPINA3主要在心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而不是在心肌細(xì)胞中。生化分析表明，Serpina3k的乳酸化增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過(guò)使用Serpina3k基因敲除小鼠和過(guò)表達(dá)乳酸化缺陷突變體的小鼠，作者發(fā)現(xiàn)Serpina3k以賴氨酸351位點(diǎn)乳酸化依賴的方式保護(hù)心臟免受損傷。機(jī)制上，缺血再灌注刺激的成纖維細(xì)胞分泌Serpina3k/SERPINA3，并通過(guò)旁分泌方式保護(hù)心肌細(xì)胞免受再灌注誘導(dǎo)的凋亡，部分通過(guò)激活心臟保護(hù)性再灌注損傷挽救激酶（RISK）和存活因子增強(qiáng)（SAFE）通路。作者的結(jié)果揭示了蛋白質(zhì)乳酸化在心臟缺血再灌注損傷中的關(guān)鍵作用，這可能為治療提供新的思路。該研究于2025年1月發(fā)表于《Nature Communication》，影響因子15.7。

技術(shù)路線

研究思路

1.全局乳酸化組分析心肌缺血/再灌注損傷

   為了全面表征梗死和再灌注心臟中蛋白質(zhì)賴氨酸乳酸化（Kla）的狀態(tài)，作者采用了一種強(qiáng)大的四維（4D）無(wú)標(biāo)記定量方法進(jìn)行全球乳酸化組和蛋白質(zhì)組分析（圖1a）。4D蛋白質(zhì)組學(xué)整合了離子遷移率這一第四維度，提高了肽段和蛋白質(zhì)的鑒定能力。9周齡小鼠分別接受假手術(shù)（Sham）、心肌梗死（MI）30分鐘或心臟缺血/再灌注（I/R）6小時(shí)處理。選擇這些時(shí)間點(diǎn)是基于先前的MI研究以及支持在刺激后12小時(shí)內(nèi)分析蛋白質(zhì)乳酸化的報(bào)告。在乳酸化組分析中，作者共鑒定出1674個(gè)Kla位點(diǎn)，涉及380種蛋白質(zhì)，其中1472個(gè)Kla位點(diǎn)來(lái)自333種蛋白質(zhì)被定量（補(bǔ)充表S1；補(bǔ)充數(shù)據(jù)1和2）。蛋白質(zhì)組分析鑒定出3279種蛋白質(zhì)，其中2759種在嚴(yán)格過(guò)濾后被定量（補(bǔ)充表S1；補(bǔ)充數(shù)據(jù)3）。乳酸化組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)均通過(guò)將修飾肽段的相對(duì)定量值除以相應(yīng)蛋白質(zhì)的相對(duì)定量值進(jìn)行歸一化處理。在乳酸化組和蛋白質(zhì)組分析中，大多數(shù)肽段由7-20個(gè)氨基酸組成，符合質(zhì)量控制要求（補(bǔ)充圖1a,b）。主成分分析顯示，I/R組的乳酸化組和蛋白質(zhì)組與Sham和MI組存在偏離，表明在這一階段發(fā)生了更大的變化（補(bǔ)充圖1c,d）。皮爾遜相關(guān)性分析顯示，Sham和MI組之間相似度更大，而I/R樣本在乳酸化組和蛋白質(zhì)組中均顯示出與MI和Sham更明顯的偏離（補(bǔ)充圖1e）。乳酸化組的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差高于蛋白質(zhì)組，但均低于30%的接受閾值（補(bǔ)充圖1f,g）。為了研究乳酸化位點(diǎn)附近的氨基酸模式，作者使用MEME套件中的MoMo工具（motif-x算法）來(lái)揭示鑒定的乳酸化位點(diǎn)附近的過(guò)代表模式。發(fā)現(xiàn)丙氨酸（A）在-4位（xxxxxxAxxx_K_xxxxxxxxxx）和賴氨酸（K）在+7位（xxxxxxxxxx_K_xxxxxxKxxx）是乳酸化的顯著過(guò)代表模式（模式得分分別為7.77和6.87）（補(bǔ)充表S2；補(bǔ)充數(shù)據(jù)4）。通過(guò)熱圖可視化乳酸化位點(diǎn)附近的氨基酸頻率。賴氨酸（K）殘基在-10和+7位富集，丙氨酸（A）殘基在-6、-4和+4位富集，甘氨酸（G）在-1位富集（補(bǔ)充圖1h；補(bǔ)充數(shù)據(jù)5）。作者還使用iceLogo調(diào)查乳酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸，觀察到類似模式（補(bǔ)充圖1i；補(bǔ)充數(shù)據(jù)6）。為了確定乳酸化是否對(duì)特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征有偏好，作者使用NetSurfP計(jì)算了乳酸化在α-螺旋、β-折疊和卷曲中的概率，但未發(fā)現(xiàn)偏好，表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)目標(biāo)賴氨酸殘基的乳酸化沒(méi)有影響（補(bǔ)充圖1j；補(bǔ)充數(shù)據(jù)7）。相應(yīng)地，所有賴氨酸殘基和乳酸化賴氨酸的表面可及性幾乎相同。

   作者進(jìn)一步檢查了MI和I/R期間全球Kla分布的變化，分別與Sham進(jìn)行比較。在MI中，約2.3%的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出乳酸化上調(diào)，而僅有約0.5%顯示出乳酸化下調(diào)。類似地，在I/R中，約4.3%的蛋白質(zhì)顯示出乳酸化上調(diào)，而僅有約0.3%顯示出乳酸化下調(diào)（圖1b；補(bǔ)充數(shù)據(jù)8）。這些結(jié)果表明，MI和I/R主要誘導(dǎo)蛋白質(zhì)乳酸化。蛋白質(zhì)組的變化與乳酸化組相似，與下調(diào)的蛋白質(zhì)相比，MI和I/R中上調(diào)的蛋白質(zhì)更多（圖1c；補(bǔ)充數(shù)據(jù)9）。采用更嚴(yán)格的截止值（log2比值=1.3），作者進(jìn)一步定量了MI和I/R中Kla位點(diǎn)和蛋白質(zhì)的變化數(shù)量。在MI中，有25個(gè)上調(diào)和2個(gè)下調(diào)的Kla位點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)18和2種蛋白質(zhì)的乳酸化上調(diào)和下調(diào)。相比之下，在I/R中，有71個(gè)上調(diào)和2個(gè)下調(diào)的Kla位點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)41和2種蛋白質(zhì)的乳酸化上調(diào)和下調(diào)，表明再灌注后乳酸化的持續(xù)影響（圖1d；補(bǔ)充數(shù)據(jù)10）。在蛋白質(zhì)組分析中，MI和I/R組分別有19和111種上調(diào)的蛋白質(zhì)（圖1e；補(bǔ)充數(shù)據(jù)11）。I/R組還有額外的26種下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖1e）。

   接下來(lái)，作者試圖研究MI和I/R期間顯著差異乳酸化和差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行基因本體（GO）分析以了解其功能相關(guān)性。乳酸化蛋白被分為三個(gè)不同的簇，基于它們隨時(shí)間的乳酸化狀態(tài)（圖1f；補(bǔ)充數(shù)據(jù)12）。第一組蛋白（乳酸化組C1）在MI期間幾乎沒(méi)有增加，隨后在I/R時(shí)急劇上升（補(bǔ)充圖2a）。許多與細(xì)胞呼吸（如Mdh1、Sdha和Ndufs1）、脂肪酸氧化（如Acamd、Hadh和Echs1）以及成年心臟發(fā)育（如Ttn、Myh6和Myh7）相關(guān)的蛋白是這一簇的創(chuàng)始成員，表明參與能量代謝和收縮的蛋白質(zhì)在IRI期間受到乳酸化的嚴(yán)格調(diào)控（圖1g和補(bǔ)充圖2a；補(bǔ)充數(shù)據(jù)13）。有趣的是，C1還包括與內(nèi)肽酶和水解酶活性負(fù)調(diào)控相關(guān)的蛋白，包括Serpina3k（SA3K）和Serpina1b（圖1g和補(bǔ)充圖2a；補(bǔ)充數(shù)據(jù)13）。第二組蛋白（乳酸化組C2）在MI期間乳酸化增加，隨后在再灌注時(shí)下降（補(bǔ)充圖2a），包括參與ATP和丙酮酸代謝過(guò)程的蛋白（如Dld、Gapdh和Pkm），以及參與肌絲滑動(dòng)和肌節(jié)組織的蛋白（如Tnnt2、Ttn和Myh6）（圖1g和補(bǔ)充圖2a；補(bǔ)充數(shù)據(jù)13）。第三組（乳酸化組C3）包括肌節(jié)蛋白（Csrp3、Ttn、Atp2a2和Myh6）和Ndufs2，其乳酸化變化最小（圖1g和補(bǔ)充圖2a；補(bǔ)充數(shù)據(jù)13）。值得注意的是，由于它們?cè)诙鄠€(gè)位點(diǎn)發(fā)生乳酸化，所有三個(gè)簇都共享了Ttn和Myh6。乳酸化組中呼吸和收縮組分的過(guò)度代表表明，它們是I/R應(yīng)激期間內(nèi)源性乳酸化的主要底物。差異表達(dá)的蛋白質(zhì)被分為兩個(gè)相反的趨勢(shì)（圖1h；補(bǔ)充數(shù)據(jù)14）。蛋白質(zhì)組簇1（C1）顯示出與乳酸化組C1高度相似的模式，而蛋白質(zhì)組C2在MI期間略有下降，隨后在I/R中迅速下降（補(bǔ)充圖2b）。有趣的是，負(fù)調(diào)控肽酶和水解酶活性的蛋白，包括SA3K、Serpina1b和Serpining1，是上調(diào)最強(qiáng)烈的蛋白之一（圖1i；補(bǔ)充數(shù)據(jù)15）。這些蛋白已知作為絲氨酸蛋白酶抑制劑，有助于阻斷某些消化酶的活性，并因在血液凝固、炎癥和氧化應(yīng)激中的調(diào)控作用而與心血管疾病相關(guān)。觀察到I/R特異性差異乳酸化和表達(dá)的蛋白質(zhì)均在絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性中表現(xiàn)出富集，表明絲氨酸蛋白酶家族蛋白可能在I/R中發(fā)揮重要作用（補(bǔ)充圖2c，補(bǔ)充數(shù)據(jù)16）。相反，下調(diào)的蛋白幾乎完全是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，表明I/R損傷后ECM發(fā)生了巨大的分解和重塑（圖1i；補(bǔ)充數(shù)據(jù)14）。

   為了進(jìn)一步了解I/R中差異乳酸化蛋白之間的關(guān)系，作者使用STRING繪制了它們的功能或物理相互作用網(wǎng)絡(luò)。如預(yù)期的那樣，存在兩組主要的蛋白：一組與肌節(jié)結(jié)構(gòu)相關(guān)（如Tnnt2、Ttn、Myh7、Myh6和Desmin），另一組與代謝相關(guān)（如Ckm、Pfkm、Mdh1、Sdha、Sdhb、Ndufs1、Ndufa8和Slc25a4）（圖1j；補(bǔ)充數(shù)據(jù)17）。兩個(gè)絲氨酸蛋白酶家族成員，SA3K和Serpina1b，與血液中的蛋白相關(guān)，包括Apoa1和Alb。SA3K還與Myh6（心肌α-肌球蛋白重鏈）和Ckm（肌酸激酶，M型）功能相關(guān)，表明SA3K可能在心肌細(xì)胞收縮中發(fā)揮作用。接下來(lái)，作者重疊了MI和I/R中在乳酸化組和蛋白質(zhì)組中顯著變化的蛋白。令人驚訝的是，除了在I/R期間乳酸化狀態(tài)顯著變化的7種蛋白與蛋白質(zhì)表達(dá)顯著變化的蛋白之間有重疊外，四組蛋白之間幾乎沒(méi)有重疊，包括血紅蛋白α鏈復(fù)合物（Hba）、血紅蛋白β成年主要鏈（Hbb-b1）、白蛋白（Alb）、載脂蛋白A1（Apoa1）、SA3K、Serpina1b和轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）（圖1k；補(bǔ)充數(shù)據(jù)18）。其中，Hba、Hbb-b1、Alb、Apoa1和Tf是血液中高度豐富的蛋白。令人驚訝的是，剩下的兩種蛋白是SA3K和Serpina1b，表明它們?cè)贗/R中具有突出且特定的作用。SA3是與小鼠Serpina3蛋白家族密切相關(guān)的僅有的人類同源物（其中之一是SA3K），已被證明是預(yù)測(cè)心肌梗死和心力衰竭不良心臟事件的有效指標(biāo)。因此，作者著手定義SA3K乳酸化在IRI中的病理生理功能及其后果。

圖1. 全局乳酸化組分析心肌缺血/再灌注損傷

2.SA3K及其乳酸化在體內(nèi)和體外缺血/再灌注損傷中增加

   為了驗(yàn)證MI和I/R期間SA3K蛋白表達(dá)的變化，作者對(duì)MI和I/R小鼠的心肌樣本進(jìn)行了Western blotting分析。與Sham和MI相比，SA3K蛋白水平增加了4.8倍，表明SA3K的增加是IRI特異性的反應(yīng)（圖2a）。一致地，免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度在I/R小鼠心臟切片中顯著高于Sham或MI（圖2b）。此外，作者通過(guò)免疫沉淀驗(yàn)證了SA3K的賴氨酸乳酸化（SA3K-Kla）。在I/R中，SA3K-Kla顯著且特異性增加（圖2c,d）。作者的質(zhì)譜/質(zhì)譜（MS/MS）數(shù)據(jù)顯示，SA3K的乳酸化發(fā)生在殘基K351上（補(bǔ)充圖3）。為了生成特異性識(shí)別SA3K-K351la的多克隆抗體，作者通過(guò)點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抗體的特異性和潛在交叉反應(yīng)性（補(bǔ)充圖4a）。與上述觀察一致，使用SA3K-K351la特異性抗體的Western blotting證實(shí)了I/R中SA3K-K351la水平的顯著增加（圖2e）。為了檢查SA3K升高的時(shí)間過(guò)程，作者在I/R 0小時(shí)至I/R 6小時(shí)之間每小時(shí)收集一次心臟組織（補(bǔ)充圖4b）。Western blotting顯示，與MI相比，K351位點(diǎn)的乳酸化水平在I/R 1小時(shí)時(shí)顯著上升，而蛋白水平在I/R 2小時(shí)開(kāi)始顯著增加，并持續(xù)至I/R 6小時(shí)（補(bǔ)充圖4c–e）。這些數(shù)據(jù)支持在心臟再灌注后，SA3K在K351位點(diǎn)的乳酸化水平迅速且顯著升高。

   觀察到SA3K幾乎不與心肌細(xì)胞（CM）標(biāo)記物ACTN2共定位（圖2b）促使作者研究增加SA3K表達(dá)的細(xì)胞基礎(chǔ)。免疫熒光顯示，在I/R中，F(xiàn)B標(biāo)記物波形蛋白（VIM）與SA3K有強(qiáng)烈的共定位（圖2f）。作者分離了原代新生小鼠CM和CFB，并檢查了基礎(chǔ)水平的SA3K mRNA表達(dá)。與CM相比，SA3K在FB中的表達(dá)水平顯著更高（圖2g）。接下來(lái)，作者通過(guò)在體外分別培養(yǎng)FB和CM于正常氧（N）、缺氧（H，1%O?，24小時(shí)）或缺氧-再氧（H-N，1%O?，24小時(shí)，隨后正常氧12小時(shí)）條件下模擬I/R。在FB中，SA3K-K351la和蛋白水平在H-N中特異性且顯著上調(diào)（圖2h）。相比之下，這種增加在CM中不存在（圖2i）。為了確定這種現(xiàn)象的保守性，作者分離了成年原代人CM和CFB。與新生小鼠心臟細(xì)胞一致，SA3（SA3K的人類同源物）也在CFB中特異性表達(dá)（圖2j）。其表達(dá)也在H-N刺激下在CFB中特異性上調(diào)（圖2k）。鑒于SA3是一種分泌蛋白，作者進(jìn)一步通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）定量培養(yǎng)人CFB的培養(yǎng)液中的SA3，一致地觀察到在H-N刺激下分泌的SA3水平顯著增加（圖2l）。為了進(jìn)一步探索H-N是否在人CM和CFB中引起SA3-Kla的變化，作者通過(guò)免疫沉淀檢查了SA3-Kla水平。在人CFB中，SA3-Kla在H-N中顯著升高，但在缺氧或CM中則沒(méi)有（圖2m,n）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SA3K及其人類同源物SA3在CFB中在蛋白表達(dá)和乳酸化水平上增加，這是I/R或H-N損傷的反應(yīng)。

圖2. SA3K及其乳酸化在體內(nèi)和體外缺血/再灌注損傷中增加

3.L-乳酸通過(guò)增強(qiáng)乳酸化依賴的蛋白穩(wěn)定性上調(diào)SA3K水平

   為了探究SA3K蛋白和乳酸化水平增加的分子基礎(chǔ)，作者觀察到在小鼠心臟梗死區(qū)域的SA3K mRNA水平并未增加（補(bǔ)充圖5a）。同樣，在體外培養(yǎng)的CM或FB中，H-N處理也未能增強(qiáng)小鼠的SA3K mRNA水平（補(bǔ)充圖5b）或人類細(xì)胞的SA3 mRNA水平（補(bǔ)充圖5c）。這些結(jié)果表明，SA3K蛋白水平的升高不太可能是由于轉(zhuǎn)錄增加的結(jié)果，這促使作者推測(cè)其調(diào)控可能發(fā)生在蛋白水平。

   作者還注意到，小鼠心臟梗死區(qū)域的全組織L-乳酸顯著增加（補(bǔ)充圖5d）。同樣，體外培養(yǎng)的新生小鼠CM和FB中的細(xì)胞內(nèi)L-乳酸也被H和H-N強(qiáng)烈上調(diào)（補(bǔ)充圖5e）。這些L-乳酸的變化與乳酸化蛋白和蛋白Kla位點(diǎn)的顯著增加相平行（圖1f）。鑒于先前的研究報(bào)告蛋白Kla水平受乳酸影響，且蛋白修飾廣泛參與蛋白翻譯后調(diào)控，作者假設(shè)I/R期間產(chǎn)生的L-乳酸通過(guò)K351調(diào)節(jié)SA3K蛋白的穩(wěn)定性。

   為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者首先將FB暴露于不同濃度的L-乳酸中，觀察到SA3K和SA3K-K351la均呈劑量依賴性增加（圖3a），表明L-乳酸誘導(dǎo)了SA3K乳酸化和蛋白表達(dá)的增加。由于細(xì)胞內(nèi)L-乳酸的產(chǎn)生依賴于糖酵解和線粒體代謝的平衡，作者測(cè)試了這兩條通路中的酶活性是否可以調(diào)節(jié)L-乳酸水平以及隨后的SA3K-K351la（圖3b）。不出所料，線粒體呼吸鏈復(fù)合體I抑制劑魚(yú)藤酮強(qiáng)烈誘導(dǎo)L-乳酸產(chǎn)生（圖3c），而乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑草酸顯著抑制L-乳酸水平（圖3c）。相應(yīng)地，草酸和魚(yú)藤酮?jiǎng)┝恳蕾囆缘亟档秃驮黾覵A3K-K351la和SA3K水平（圖3d,e），進(jìn)一步暗示乳酸直接調(diào)節(jié)了SA3K-K351la和SA3K。這些發(fā)現(xiàn)表明，外源性和內(nèi)源性乳酸同時(shí)調(diào)節(jié)了SA3K-K351la和SA3K。SA3K-K351la和SA3K之間的正相關(guān)表明，SA3K-K351la促進(jìn)了SA3K蛋白的穩(wěn)定性。

   為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，作者用cycloheximide（CHX）處理細(xì)胞以抑制蛋白合成，并在有無(wú)L-乳酸或草酸添加的情況下隨時(shí)間定量蛋白表達(dá)。計(jì)算得出的SA3K半衰期從2.98小時(shí)增加到6.74小時(shí)（L-乳酸處理），而在乳酸被草酸抑制后，半衰期下降到1.92小時(shí)（圖3f）。在存在蛋白酶體抑制劑MG132和CHX的情況下，蛋白水平保持穩(wěn)定（圖3f），表明乳酸在維持SA3K蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮了作用。在成人原代人CFB中也觀察到類似的現(xiàn)象，L-乳酸處理使SA3的半衰期從4.12小時(shí)增加到6.36小時(shí)，而草酸處理使SA3的半衰期縮短到2.16小時(shí)（補(bǔ)充圖5f）。為了進(jìn)一步評(píng)估這種調(diào)控是否由SA3K-K351la介導(dǎo)，作者構(gòu)建了一個(gè)突變體，即帶有FLAG標(biāo)簽的SA3K（K351R），并將其與野生型（WT）重組蛋白進(jìn)行了比較。計(jì)算得出的外源WT-SA3K的半衰期在L-乳酸處理后從4.66小時(shí)增加到6.71小時(shí)，而K351R突變體的半衰期幾乎與WT蛋白相同（4.84小時(shí)）（圖3g），表明K351la對(duì)于乳酸穩(wěn)定SA3K是必需的。

   為了測(cè)試這一觀點(diǎn)，作者構(gòu)建了一個(gè)突變體，即帶有FLAG標(biāo)簽的SA3K（K351R），并將其與野生型（WT）重組蛋白進(jìn)行了比較。計(jì)算得出的外源WT-SA3K的半衰期在L-乳酸處理后從4.66小時(shí)增加到6.71小時(shí)，而K351R突變體的半衰期幾乎與WT蛋白相同（4.84小時(shí)）（圖3g），表明K351la對(duì)于乳酸穩(wěn)定SA3K是必需的。

   為了排除乙?；⊿A3K-Kac）調(diào)節(jié)SA3K蛋白穩(wěn)定性的可能性，作者首先檢查了在增加或減少L-乳酸濃度時(shí)SA3K-Kac水平的變化。免疫沉淀顯示，無(wú)論是細(xì)胞外L-乳酸（L-乳酸處理）還是細(xì)胞內(nèi)乳酸（草酸或魚(yú)藤酮處理）的變化對(duì)SA3K-Kac均無(wú)影響（補(bǔ)充圖6a）。在培養(yǎng)基中加入100μM乙酰輔酶A略微延長(zhǎng)了內(nèi)源性SA3K的半衰期（3.77小時(shí)），但對(duì)重組SA3K-WT的半衰期（4.60小時(shí)）無(wú)影響（補(bǔ)充圖6b）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明L-乳酸通過(guò)抑制SA3K的降解來(lái)發(fā)揮作用，而不是通過(guò)乙?；?。

圖3. L-乳酸通過(guò)增強(qiáng)乳酸化依賴的蛋白穩(wěn)定性上調(diào)SA3K水平

4.SA3K是再灌注損傷中心臟保護(hù)的重要驅(qū)動(dòng)因子

   為了直接評(píng)估SA3K在IRI中的作用，作者生成了SA3K基因敲除（SA3K-KO）小鼠（圖4a和補(bǔ)充圖7a）。一組野生型（WT）小鼠和兩組SA3K-KO小鼠分別被結(jié)扎30分鐘，然后再灌注6小時(shí)以模擬I/R。在第二組SA3K-KO小鼠中，在再灌注時(shí)注射了重組純化的His標(biāo)簽SA3K（0.5 mg/kg）（圖4a）。2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）和伊文思藍(lán)染色在I/R后1天顯示，各組間風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域（AAR）相當(dāng)（圖4b,c）。然而，與WT對(duì)照組相比，SA3K-KO小鼠的AAR標(biāo)準(zhǔn)化梗死面積顯著增加，而通過(guò)注射重組SA3K可以挽救（圖4d）。為了評(píng)估心臟損傷，作者測(cè)量了血清中心臟肌鈣蛋白T、心臟肌鈣蛋白I和肌酸激酶MB（CK-MB）的水平。這些標(biāo)志物在SA3K-KO小鼠中顯著增加，與WT對(duì)照組相比，并且通過(guò)注射外源性SA3K部分減輕（圖4e–g）。通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色評(píng)估的凋亡細(xì)胞比例在I/R后1天在SA3K缺陷小鼠中顯著增加，而SA3K的注射顯著逆轉(zhuǎn)了凋亡的增加（圖4h）。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（基線、7天、14天和28天）進(jìn)行超聲心動(dòng)圖分析以評(píng)估心臟功能變化。SA3K-KO小鼠的基線心臟功能與WT對(duì)照小鼠無(wú)法區(qū)分（補(bǔ)充圖7c–h）。在7天、14天和28天時(shí)，與WT對(duì)照組相比，SA3K缺陷小鼠的射血分?jǐn)?shù)（EF）嚴(yán)重受損，而His-SA3K注射提供了適度的保護(hù)效果（圖4i,j，補(bǔ)充圖7b,c）。類似的趨勢(shì)在分?jǐn)?shù)縮短（FS）中觀察到（圖4j，補(bǔ)充圖7d）。左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）或收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）在D28時(shí)在SA3K-KO小鼠中顯著增加，表明I/R后發(fā)生心室擴(kuò)張，而通過(guò)補(bǔ)充外源性His-SA3K部分挽救（圖4j）。這些參數(shù)中的一些在D7時(shí)就出現(xiàn)了顯著變化（補(bǔ)充圖7e–h）。在I/R后28天，作者通過(guò)Masson三色染色分析心臟纖維化。與WT心臟相比，SA3K-KO心臟顯示出膠原沉積顯著增加，而SA3K注射顯著減輕了纖維化（圖4k和補(bǔ)充圖7f）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SA3K為心臟提供了針對(duì)IRI的保護(hù)。

圖4. SA3K是再灌注損傷中心臟保護(hù)的重要驅(qū)動(dòng)因子

5.SA3K在K351位點(diǎn)的乳酸化對(duì)心臟保護(hù)至關(guān)重要

   為了深入了解K351la在IRI中的作用，作者生成了表達(dá)野生型SA3K（SA3K-WT）或突變型SA3K（SA3K-K351R）的腺相關(guān)病毒血清型9（AAV9）（圖5a和補(bǔ)充圖8a）。小鼠通過(guò)尾靜脈注射AAV9。I/R手術(shù)4周后，通過(guò)TTC染色評(píng)估梗死面積。與EV對(duì)照組相比，表達(dá)WT SA3K的小鼠在I/R后1天的梗死面積顯著減少，而表達(dá)K351R突變型SA3K的小鼠與EV對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明K351對(duì)于SA3K的保護(hù)作用至關(guān)重要（圖5b–d）。血清中cTnI和CK-MB的水平在表達(dá)WT SA3K的小鼠中顯著降低，而在表達(dá)K351R突變型SA3K的小鼠中則沒(méi)有（圖5e–g）。外源性表達(dá)SA3K-WT顯著減輕了I/R誘導(dǎo)的凋亡，而SA3K-K351R則未能顯示出與EV對(duì)照組相比的任何保護(hù)作用（圖5h）。超聲心動(dòng)圖分析顯示，病毒注射并未干擾基線心臟功能（補(bǔ)充圖8c–h）。SA3K-WT顯著改善了心臟功能，這種效果從7天持續(xù)到28天，而SA3K-K351R則未能顯示出任何改善（圖5i,j，補(bǔ)充圖8b–h）。最后，28天時(shí)的纖維化評(píng)估顯示，SA3K-WT顯著減輕了纖維化，而SA3K-K351R則沒(méi)有（圖5g和補(bǔ)充圖8e）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，SA3K在K351位點(diǎn)的乳酸化對(duì)于SA3K的心臟保護(hù)作用至關(guān)重要，表明蛋白半衰期而非蛋白總量決定了IRI的保護(hù)。

   SA3K通過(guò)旁分泌信號(hào)保護(hù)心肌細(xì)胞免受IRI誘導(dǎo)的凋亡。

圖5. SA3K在K351位點(diǎn)的乳酸化對(duì)心臟保護(hù)至關(guān)重要

6．FBs分泌的SA3K通過(guò)旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)CM免受IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

   重新分析TUNEL染色，特別是針對(duì)CM（TUNEL+ACTN2+）的分析揭示了SA3K最顯著地改變了CM的凋亡（補(bǔ)充圖9a,b）。鑒于CM本身幾乎不表達(dá)SA3K（圖2），并且由于CM特異性的SA3K對(duì)H-N的響應(yīng)最小（圖2），作者假設(shè)FB通過(guò)旁分泌相互作用保護(hù)CM免受IRI的影響，主要通過(guò)分泌SA3K介導(dǎo)。

   為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先從新生小鼠或成人人類心臟組織中分離出FB和CM，并分別培養(yǎng)（圖6a）。將FB在正常氧或H-N條件下培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液分別用于CM培養(yǎng)，后者隨后接受H-N處理。在一組接受H-N條件培養(yǎng)液的CM中，作者使用SA3K或SA3中和抗體（Nab）來(lái)確定SA3K/SA3在旁分泌效應(yīng)中的作用（圖6a）。H-N條件培養(yǎng)液顯著抑制了小鼠CM的凋亡，這一效應(yīng)被Nab抵消（圖6b,c）。相應(yīng)地，小鼠CM中的裂解caspase 3和Bax水平也被H-N條件培養(yǎng)液抑制，而用Nab處理的培養(yǎng)液對(duì)CM凋亡的保護(hù)作用很?。▓D6d,e）。在成人原代人FB和CM中也觀察到類似的結(jié)果（圖6d,e）。此外，在新生小鼠和成人原代細(xì)胞中，H-N條件培養(yǎng)液顯著抑制了乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，并增強(qiáng)了ATP水平，表明CM的存活率更高，這些效應(yīng)也被Nab抵消（圖6f–h）。然而，細(xì)胞活性氧（ROS）和呼吸作用受到的影響最?。ㄑa(bǔ)充圖9c，補(bǔ)充圖10）。這些結(jié)果表明，在IRI期間，成纖維細(xì)胞（FBs）產(chǎn)生了一種分泌物，可以保護(hù)心肌細(xì)胞（CMs）免受IRI誘導(dǎo)的凋亡，這種效應(yīng)主要通過(guò)分泌的SA3K/SA3介導(dǎo)。

   為了進(jìn)一步研究SA3K在IRI中的保護(hù)作用，作者通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的敲低在FBs中耗盡SA3K，并將條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到CM培養(yǎng)液中，隨后對(duì)CM進(jìn)行H-N處理（圖6i和補(bǔ)充圖9d,e）。與非靶向（NT）對(duì)照組相比，shSA3K#1顯著增加了細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的比例，而shSA3K#2也顯示出增加的趨勢(shì)（圖6j,k）。同樣，SA3K的耗盡還增強(qiáng)了裂解caspase 3和Bax的表達(dá)，以及LDH的釋放（圖6l,m，補(bǔ)充圖9f）。然而，ATP水平、ROS和線粒體功能并未受到影響（補(bǔ)充圖9g,h，補(bǔ)充圖10）。在成人原代人CFBs中耗盡SA3也產(chǎn)生了類似的結(jié)果（圖6l,n，補(bǔ)充圖9d–h）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，SA3K/SA3由FBs分泌，能夠保護(hù)CMs免受IRI誘導(dǎo)的凋亡。

   此外，作者通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)或向CM培養(yǎng)液中添加重組His-SA3K，直接在CMs中增加SA3K的表達(dá)（補(bǔ)充圖11a）。在H-N刺激后，觀察到CMs受到顯著保護(hù)，表現(xiàn)為凋亡標(biāo)志物下調(diào)（補(bǔ)充圖11b,c）。這一發(fā)現(xiàn)表明，SA3K能夠保護(hù)CMs免受IRI誘導(dǎo)的凋亡。

   為了了解這種保護(hù)是否依賴于K351位點(diǎn)的乳酸化，作者在FBs中異位表達(dá)SA3K-WT和SA3K-K351R，并評(píng)估它們的保護(hù)效率（圖6o，補(bǔ)充圖9i,j）。與體內(nèi)數(shù)據(jù)類似，SA3K-WT顯著抑制了CMs的凋亡，而SA3K-K351R未能顯示出任何效果（圖6p,q）。SA3K-K351R也未能抑制裂解caspase 3和Bax的表達(dá)，或LDH的釋放，而WT形式則可以（圖6r，補(bǔ)充圖9k）。再次，ATP水平、ROS和線粒體呼吸并未受到影響（補(bǔ)充圖9l,m），表明SA3K對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)并非通過(guò)線粒體損傷介導(dǎo)。綜上所述，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了Kla在CMs中的調(diào)節(jié)作用。

圖6. FBs分泌的SA3K/SA3通過(guò)旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)CM免受IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

7.SA3K通過(guò)抑制WNT通路并激活RISK和SAFE通路保護(hù)CMs

   為了探索SA3K保護(hù)作用的分子機(jī)制，作者利用上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（圖6i,o），并分析了CMs中改變的信號(hào)通路。作者首先分析了AMPK信號(hào)通路，這是一條經(jīng)典的保護(hù)性心肌通路。然而，SA3K/SA3水平未能調(diào)節(jié)小鼠或人類CMs中AMPK信號(hào)通路的活性（補(bǔ)充圖12a–f）。進(jìn)一步地，鑒于SA3K已被報(bào)道在血管生成中抑制WNT信號(hào)通路，作者試圖確定WNT通路是否在SA3K水平變化后發(fā)生改變。在小鼠FBs中過(guò)表達(dá)SA3K或在成人原代人FBs中過(guò)表達(dá)SA3，可導(dǎo)致CMs中pLRP和β-catenin水平顯著下降（補(bǔ)充圖12g–i）。相反，當(dāng)使用條件培養(yǎng)液處理時(shí)，來(lái)自SA3K耗盡的FBs的培養(yǎng)液使pLRP顯著增加，而β-catenin也顯示出增加的趨勢(shì)（補(bǔ)充圖12g–i）。使用成人原代人CFBs的條件培養(yǎng)液處理成人原代人CMs時(shí)，觀察到類似但較弱的效果（補(bǔ)充圖12g–i）。

   鑒于SA3K的促存活效應(yīng)，作者進(jìn)一步測(cè)試了它是否促進(jìn)經(jīng)典的保護(hù)性RISK和SAFE通路。RISK通路是一組促存活激酶通路，包括AKT和ERK1/2，它們賦予心臟對(duì)IRI的保護(hù)作用。在小鼠FBs中過(guò)表達(dá)SA3K或在成人原代人FBs中過(guò)表達(dá)SA3，導(dǎo)致相應(yīng)物種CMs中p-AKT和p-ERK信號(hào)顯著上調(diào)（圖7a–d）。相反，SA3K的沉默顯著抑制了小鼠CMs中AKT和ERK1/2的磷酸化。在人類細(xì)胞中觀察到類似的趨勢(shì)，但只有shSA3#1的p-ERK達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7c,d）。SAFE通路涉及JAK和STAT-3的激活，已被證明在小鼠、豬和人類中IRI保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠FBs中過(guò)表達(dá)SA3K顯著增加了N-H刺激的CMs中JAK2和STAT3的磷酸化（圖7e,f）。相反，SA3K的耗盡導(dǎo)致了相反的趨勢(shì)。在成人原代人細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，表現(xiàn)為在shSA3#2耗盡時(shí)STAT3磷酸化顯著抑制（圖7g,h）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，SA3K通過(guò)抑制WNT信號(hào)通路并激活RISK和SAFE保護(hù)性通路來(lái)保護(hù)CMs免受IRI誘導(dǎo)的凋亡。

圖7. SA3K通過(guò)抑制WNT通路并激活RISK和SAFE通路保護(hù)CMs

參考文獻(xiàn)

1．Wang L, Li D, Yao F, Feng S, Tong C, Rao R, Zhong M, Wang X, Feng W, Hu Z, Jin B, Wang L, Hu S, Zhou B. Serpina3k lactylation protects from cardiac ischemia reperfusion injury. Nat Commun. 2025 Jan 25;16(1):1012.