去泛素化酶USP24通過穩(wěn)定DHODH蛋白抑制三陰性乳腺癌的鐵死亡

   三陰性乳腺癌是一種侵襲性極強(qiáng)的乳腺癌亞型，其治療選擇有限且預(yù)后不良。盡管鐵死亡這種依賴鐵離子的程序性細(xì)胞死亡形式在腫瘤抑制中扮演著重要角色，但其在三陰性乳腺癌中的具體分子機(jī)制在很大程度上仍屬未知。在本研究中，我們鑒定出去泛素化酶USP24是在人三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡過程中，關(guān)鍵去泛素化酶中變化最為顯著的一個(gè)。沉默USP24能夠增強(qiáng)鐵死亡介導(dǎo)的腫瘤抑制作用。從機(jī)制上講，USP24與DHODH直接相互作用并對其進(jìn)行去泛素化，這一過程對于維持輔酶Q的還原狀態(tài)以及保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化損傷至關(guān)重要。相應(yīng)地，通過藥理學(xué)方法抑制USP24，能夠通過一條依賴于DHODH的通路，在體外和體內(nèi)模型中與鐵死亡誘導(dǎo)劑產(chǎn)生強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了USP24是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，可用于增強(qiáng)三陰性癌細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。本文于2025年7月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=9.6）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）在三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵死亡的過程中USP24會選擇性地下調(diào)

   為探究鐵死亡過程中去泛素化酶的變化，我們研究了RSL3對MDA-MB-231細(xì)胞中多種DUBs蛋白水平的影響。Western blot結(jié)果顯示，RSL3以劑量和時(shí)間依賴性的方式顯著下調(diào)了USP24的蛋白水平（圖1A, B）。該效應(yīng)并非僅限于MDA-MB-231細(xì)胞，因?yàn)樵贛DA-MB-468 細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果，RSL3同樣誘導(dǎo)了USP24蛋白水平的顯著降低（圖1C, D）。RSL3處理還會導(dǎo)致MDA-MB-468細(xì)胞中USP38水平下降，而在MDA-MB-231細(xì)胞中對USP38的表達(dá)沒有影響，這表明USP38的調(diào)控具有細(xì)胞類型依賴性（圖1A, B）。然而，RSL3對其他DUBs的影響則相對較?。▓D1A, B）。我們還研究了RSL3對非TNBC細(xì)胞（如T47D和MCF-7）中USP24蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，RSL3并沒有改變這些乳腺癌細(xì)胞中USP24的表達(dá)，這表明鐵死亡誘導(dǎo)的USP24下調(diào)是細(xì)胞型選擇性的（圖1E， F）。為了確定這種作用是否僅針對RSL3，我們評估了其他鐵死亡誘導(dǎo)劑對USP24表達(dá)的影響。與RSL3類似，其他GPX4抑制劑，包括ML162、ML210和FIN56，下調(diào)USP24基因和蛋白水平（圖1G、H）。相反，erastin對USP24蛋白水平?jīng)]有影響，僅對其基因表達(dá)有很小的影響（圖1G，H）。這些發(fā)現(xiàn)表明GPX4抑制，而不是SLC7A11阻斷，與USP24下調(diào)特異性相關(guān)。鑒于DUB在泛素化中的關(guān)鍵調(diào)控作用，我們進(jìn)一步評估了GPX4抑制劑對MDA-MB-231細(xì)胞泛素化動(dòng)力學(xué)的影響。用RSL3、ML162、ML210或FIN56處理導(dǎo)致泛素化蛋白的顯著積累，而erastin未能誘導(dǎo)這種效應(yīng)（圖1I，J）。為了證實(shí)鐵死亡與這些觀察結(jié)果之間的關(guān)系，我們測試了GPX4抑制劑與ferrostatin-1的組合。ferrostatin-1完全逆轉(zhuǎn)了GPX4抑制劑誘導(dǎo)的泛素化積累和USP24下調(diào)（圖1K、L）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明GPX4抑制劑誘導(dǎo)了TNBC細(xì)胞中USP24的下調(diào)并促進(jìn)了泛素化的積累。

2）敲低USP24可促進(jìn)TNBC細(xì)胞鐵死亡

   上述研究結(jié)果表明，USP24可能在鐵死亡調(diào)控中發(fā)揮潛在作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中建立了USP24穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系。結(jié)果顯示，敲低USP24顯著增強(qiáng)了這兩種細(xì)胞系對RSL3所致生長抑制的敏感性（圖2A-C）。此外，在MDA-MB-231細(xì)胞中，USP24的敲低增強(qiáng)了其他GPX4抑制劑（包括ML162、ML210和FIN56）的抗腫瘤效果，而對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡影響甚微（圖2D）。為進(jìn)一步確認(rèn)USP24在鐵死亡中的作用，我們采用PI染色法評估了細(xì)胞死亡情況。結(jié)果表明，USP24敲低顯著增強(qiáng)了RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖2E）。此外，細(xì)胞遷移和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，USP24敲低增強(qiáng)了RSL3的抗腫瘤效果，降低了三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移能力（圖2F）和集落形成能力（圖2G）。為更貼近腫瘤微環(huán)境，我們利用了MDA-MB-231細(xì)胞的三維球模型。與二維培養(yǎng)結(jié)果一致，USP24敲低同樣增強(qiáng)了RSL3在三維球模型中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖2H, I）。另外，USP24敲低增加了TNBC細(xì)胞中由RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化（圖2J）。重要的是，使用ferrostatin-1處理，可以逆轉(zhuǎn)USP24敲低細(xì)胞中觀察到的鐵死亡敏感性和脂質(zhì)過氧化水平的升高，而凋亡抑制劑Z-VAD-FMK則無此效果（圖2K, L）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，USP24通過調(diào)節(jié)鐵死亡敏感性和脂質(zhì)過氧化水平，在三陰性乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮著抗鐵死亡蛋白的作用。

3）USP24抑制與鐵死亡誘導(dǎo)劑協(xié)同增強(qiáng)TNBC細(xì)胞的抗腫瘤作用

   為進(jìn)一步評估USP24在鐵死亡中的作用，我們使用了已知的USP24抑制劑WP1130，以研究其對TNBC細(xì)胞鐵死亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WP1130與鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3聯(lián)合處理表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，其協(xié)同得分高達(dá)11.937（圖3A）。進(jìn)一步的PI染色和脂質(zhì)過氧化檢測結(jié)果顯示，WP1130增強(qiáng)了RSL3在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化（圖3B, C）。此外，細(xì)胞遷移和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，WP1130與RSL3聯(lián)用能夠抑制TNBC細(xì)胞的遷移（圖3D）并降低其集落形成能力（圖3E）。與二維培養(yǎng)的結(jié)果一致，WP1130與RSL3聯(lián)用也顯著增強(qiáng)了細(xì)胞毒性效應(yīng)，能明顯減小腫瘤球的大小并增加細(xì)胞死亡（圖3F, G）。這些研究結(jié)果證實(shí)，通過WP1130抑制USP24能夠增強(qiáng)TNBC細(xì)胞的鐵死亡，從而為靶向USP24以強(qiáng)化鐵死亡驅(qū)動(dòng)的抗癌策略提供了有力的證據(jù)，并凸顯了其巨大的治療潛力。

4）DHODH是TNBC細(xì)胞中USP24的底物

   為了闡明USP24抑制鐵死亡的具體機(jī)制，我們假設(shè)USP24可能影響關(guān)鍵鐵死亡相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們檢測了USP24基因敲低對幾種鐵死亡相關(guān)蛋白的影響。Western blot檢測顯示，USP24敲低顯著下調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中的DHODH蛋白水平，而對其他蛋白的影響相對較小，包括GPX4、SLC7A11、FSP1、ACSL4、NRF2、ALOX12、鐵蛋白和p53（圖4A， B）。USP24的敲低不影響MDA-MB-231細(xì)胞中GSS的表達(dá)，但會下調(diào)MDA-MB-468細(xì)胞中GSS的表達(dá)，表明GSS的調(diào)節(jié)是細(xì)胞類型依賴性的（圖4A， B）。使用USP24抑制劑WP1130處理雖能降低DHODH的蛋白水平，卻并不影響其基因表達(dá)（圖4C, D）。鑒于WP1130也能抑制USP9X，我們進(jìn)一步探究了USP9X對DHODH蛋白表達(dá)的影響。然而，我們的結(jié)果顯示，敲低USP9X并不影響DHODH的蛋白水平（圖4E, F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP24是通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制來調(diào)控DHODH蛋白水平的。為進(jìn)一步探究USP24是否在翻譯后水平影響DHODH，我們使用Cycloheximide來抑制蛋白質(zhì)的合成。盡管阻斷了蛋白質(zhì)的合成，敲低USP24依然降低了TNBC細(xì)胞中DHODH的蛋白水平（圖4G, H），這支持了USP24在翻譯后水平調(diào)控DHODH蛋白穩(wěn)定性的假說。由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解主要通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）或自噬發(fā)生，因此我們試圖確定哪種途徑參與了DHODH的降解。蛋白酶體抑制劑MG132，而不是自噬抑制劑氯喹（CQ）處理，導(dǎo)致DHODH蛋白顯著積累（圖4I，J），表明DHODH主要通過UPS降解。此外，MG132在USP24敲低的MDAMB- 231和MDA-MB-468細(xì)胞中有效阻斷了DHODH的降解（圖4K， L），進(jìn)一步證實(shí)了UPS在DHODH穩(wěn)定性中的作用。

5）USP24通過穩(wěn)定DHODH蛋白抑制鐵死亡

   DUB的主要功能是從底物蛋白中去除泛素，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證USP24是否直接與DHODH相互作用，我們進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中USP24與DHODH免疫共沉淀（圖5A，B）。此外，免疫熒光分析顯示，USP24和DHODH主要共定位于MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，支持它們的功能關(guān)聯(lián)（圖5C，D）。為了進(jìn)一步研究功能關(guān)系，我們檢測了USP24敲低對DHODH泛素化的影響。USP24敲低顯著增加了DHODH的總泛素化和K48連接的泛素化，這表明USP24通過催化DHODH的去泛素化來穩(wěn)定DHODH（圖5E，F(xiàn)）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了USP24通過泛素化調(diào)控維持DHODH蛋白穩(wěn)定性的關(guān)鍵作用。接下來，為確定USP24介導(dǎo)的鐵死亡抑制是否依賴于DHODH，我們在USP24敲低的細(xì)胞中過表達(dá)了DHODH。結(jié)果顯示，過表達(dá)DHODH挽救了由RSL3處理和USP24敲低在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖5G-I）。此外，細(xì)胞遷移和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)DHODH減弱了USP24敲低對細(xì)胞遷移和增殖的抑制作用（圖5J, K）。一致地，恢復(fù)DHODH的表達(dá)降低了USP24敲低細(xì)胞中升高的脂質(zhì)過氧化水平（圖5L）。從機(jī)制上講，DHODH催化CoQ還原為其活性形式——CoQH?，這對于減輕脂質(zhì)過氧化和鐵死亡至關(guān)重要。為進(jìn)一步驗(yàn)證該機(jī)制，我們向USP24敲低的細(xì)胞中補(bǔ)充了線粒體靶向的CoQH?類似物——mitoQH?。補(bǔ)充mitoQH?有效保護(hù)了MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞免受USP24敲低所觸發(fā)的鐵死亡，從而證實(shí)了DHODH活性在抑制鐵死亡中的關(guān)鍵作用（圖5M）?？傊?，USP24通過去泛素化作用穩(wěn)定DHODH的蛋白水平，從而抑制TNBC細(xì)胞中的鐵死亡。這種穩(wěn)定作用增強(qiáng)了DHODH的活性，促進(jìn)了CoQH?的產(chǎn)生并減輕了脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致TNBC細(xì)胞產(chǎn)生鐵死亡抗性。

6）USP24在體內(nèi)抑制RSL3誘導(dǎo)的TNBC細(xì)胞的腫瘤抑制

   為探究USP24在體內(nèi)的鐵死亡作用，我們通過將USP24敲低及對照的MDA-MB-231細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)，建立了一個(gè)皮下異種移植瘤模型（圖6A）。待腫瘤形成后，我們用鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3對小鼠進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，USP24敲低增強(qiáng)了RSL3誘導(dǎo)的腫瘤抑制作用，具體表現(xiàn)為腫瘤體積（圖6B）、腫瘤大?。▓D6C）和腫瘤重量（圖6D）的顯著降低，而對小鼠的體重沒有影響（圖6E）。免疫組化分析顯示，在USP24敲低的腫瘤中，DHODH和增殖標(biāo)志物Ki67的水平顯著降低，同時(shí)4-HNE的水平升高，但cleaved caspase-3的水平未發(fā)生改變（圖6F）。同樣地，使用USP24抑制劑WP1130進(jìn)行藥理學(xué)干預(yù)，也顯著促進(jìn)了RSL3在TNBC細(xì)胞中介導(dǎo)的腫瘤抑制作用和脂質(zhì)過氧化（圖7A-F）。WP1130與RSL3聯(lián)用顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤效果，且對小鼠體重沒有不良影響。這些研究結(jié)果證實(shí)，USP24通過穩(wěn)定DHODH來抑制RSL3誘導(dǎo)的體內(nèi)腫瘤抑制作用，從而支持TNBC腫瘤的存活。

結(jié)論：

我們證實(shí)，USP24通過其去泛素化作用穩(wěn)定DHODH，從而成為三陰性乳腺癌中鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。我們的研究為泛素化與鐵死亡之間的相互作用提供了新的見解，并表明USP24有望成為一個(gè)極具前景的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Yang L, An X, Yang S, Lin X, Chen Z, Xue Q, Chen X, Wang Y, Yan D, Chen S, Fan Y, Tang D, Yu W, Liu J, Chen X. The deubiquitinase USP24 suppresses ferroptosis in triple-negative breast cancer by stabilizing DHODH protein. Cell Death Dis. 2025 Jul 26;16(1):564. doi: 10.1038/s41419-025-07895-4.