來自人類尿液干細胞的外泌體的DMBT1通過促進血管的生成加速糖尿病創(chuàng)傷修復

來自人類尿液干細胞的外泌體的DMBT1通過促進血管的生成加速糖尿病創(chuàng)傷修復

慢性非治愈性傷口是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，需要先進的治療策略。外泌體是細胞旁分泌作用的關鍵介質(zhì)，可以直接作為組織修復和再生的治療劑。在2018年2月7日發(fā)表于期刊《Theranostics》(IF=8.766)的《Exosomal DMBT1 from human urine-derived stem cells facilitates diabetic wound repair by promoting Angiogenesis》中，作者探討了人類尿源性干細胞（USC-Exos）對糖尿病傷口愈合的作用和機制。

用流式細胞儀和多向分化潛能分析描述USCs的特點。USCs-Exos從USCs的條件培養(yǎng)基中分離，并通過透射電鏡和流式細胞儀鑒定。然后作者進行了一系列功能分析去評估USC-Exos對創(chuàng)面愈合相關細胞活性的影響。另外，作者通過蛋白質(zhì)組學分析檢測了USC- Exos和USCs的蛋白圖譜差異，篩選出USC- Exos和USCs顯著差異蛋白。USC- Exos在STZ誘導的糖尿病小鼠傷口愈合的影響通過測量傷口閉合率、組織學和免疫熒光分析進行檢測。同時，評估了候選蛋白在USC-Exos誘導的內(nèi)皮細胞血管生成活性調(diào)節(jié)和糖尿病傷口愈合中的作用。

研究發(fā)現(xiàn)USCs 呈CD29、CD44，CD73和CD90陽性，同時呈現(xiàn)CD34和CD45陰性。USCs能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。USC- Exos呈現(xiàn)出杯形或平均直徑為51.57±2.93 nm的球形外觀，且CD63和TSG101呈陽性。USC- Exos可以增強傷口愈合相關細胞的功能特性包括內(nèi)皮細胞生成血管的活性。USC -Exos富含參與傷口愈合相關生物學過程的蛋白質(zhì)。特別是促血管生成蛋白DMBT1在USC -Exos中高度表達。進一步的功能實驗表明，DMBT1蛋白是USC-Exos誘導的促內(nèi)皮細胞血管生成應答以及糖尿病小鼠中的血管生成和傷口愈合所需的。作者的研究成果表明，USC-Exos可能通過轉移DMBT1蛋白促進血管生成，這可能成為糖尿病組織創(chuàng)傷愈合的有前途的治療策略。

技術路線：

實驗結果

1.USC和USC-Exos分離與鑒定

圖1. USC和USC-Exos的鑒定。（A）USCs顯示出紡錘狀的形態(tài)。通過茜素紅S染色（B-a），油紅O染色（B-b）和阿爾新藍染色（B-c）證明，USCs能夠分化成成骨細胞，脂肪細胞或軟骨細胞。（C）流式細胞術分析USCs上的細胞表面標記。（D）透射電子顯微鏡下USC-Exos的形態(tài)學。（E）外泌體直徑分布。（F）流式細胞儀鑒定USC-Exos。

2.USC-Exos促進角質(zhì)細胞和成纖維細胞的增殖遷移

圖2. USC-Exos增強角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的增殖遷移。（A）PKH67標記的熒光顯微鏡分析人類角質(zhì)形成細胞HaCaT和皮膚成纖維細胞 （HSFs）的USC-Exos內(nèi)化作用。（B）通過CCK-8分析檢測接受不同處理下的HaCaT和HSF的細胞增殖情況。（C）（D）用USC-Exos或PBS處理的HaCaT中劃痕實驗；（E）（F）通過transwell測定檢測由USC-Exos或等體積的PBS孵育的HSF的遷移。

3.USC-Exos增強內(nèi)皮細胞生成血管的活性

圖3. USC-Exos增強內(nèi)皮細胞生成血管的活性。（A）熒光顯微鏡分析顯示USC-Exos被人類微血管內(nèi)皮細胞（HMECs）攝取。（B）（C）小管形成實驗檢測USC-Exos或PBS處理的HMEC。（D）CCK-8分析結果顯示，USC-Exos孵育HMEC后，細胞增殖能力增強。（E-H）Transwell分析和劃痕傷口愈合測定顯示USC-Exos孵育增強了HMEC的遷移和侵襲能力。

4.USC和USC-Exos的蛋白質(zhì)組學分析

圖4. USC和USC-Exos孵育組的蛋白質(zhì)組學分析。(A)GO功能富集顯示差異表達蛋白參與一系列傷口愈合相關的生物學過程。 (B）與USC孵育組相比，USC-Exos組中血管生成相關蛋白和外泌體標志物的表達情況。（C）Western blot實驗驗證USC-Exos和USCs中的DMBT1，VEGF-A和一系列外泌體標記蛋白的表達情況。

5.DMBT1介導USC-Exos在內(nèi)皮細胞上促血管生成的作用

圖5. DMBT1介導的USC-Exos在內(nèi)皮細胞上促血管生成作用。（A）通過qRT-PCR分析進行靶向DMBT1的shRNA抑制效率的驗證。（B）用Western印跡法驗證USCsshDMBT1 #1-Exos和USCsCon shRNA-Exos。（C）通過CCK-8分析測試經(jīng)過不同處理的HMEC的增殖。（D-G）通過劃傷試驗檢測HMEC的遷移。（H）HMEC中的管形成測定的代表性圖像。（I-K）定量分析總管（H）中的長度，總分支點和總循環(huán)。（L）通過western印跡處理檢測HMECs中VEGF-A，Akt和p-Akt蛋白水平的變化。

6.外泌體的DMBT1加速糖尿病小鼠皮膚傷口的愈合

圖6.外泌體DMBT1加速糖尿病小鼠的皮膚傷口愈合。（A）用PBS處理的傷口的總視圖。（B）接受不同治療的傷口閉合率。（C）傷口切片的H＆E染色。（D）（C）中瘢痕寬度的定量分析和上皮再生的程度。（E）傷口切片的Masson三色染色。（F）（E）中Masson染色區(qū)域的平均強度的定量分析。（G）傷口切片染色的ki67的代表性圖像。（H）在（F）中ki67陽性細胞數(shù)量的定量研究。

7.外泌體的DMBT1促進糖尿病小鼠傷口部位的血管生成

圖7。外泌體DMBT1促進糖尿病小鼠創(chuàng)面血管生成。（A）用PBS，USCsCon處理的傷口的總視圖。在傷口處發(fā)現(xiàn)新形成的血管。（B）傷口切片的CD31免疫熒光染色。（C）（B）中血管密度的定量分析。