HBV感染患者的肝臟和血液免疫細(xì)胞景觀

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        HBV感染的綜合免疫景觀是實(shí)現(xiàn)HBV治愈的關(guān)鍵，但目前尚未完全了解HBV感染患者的免疫特征。本文對23個人的46個配對肝臟和血液樣本的243 000個細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，其中包括6個免疫耐受者、5個免疫活性者（IA）、3個急性恢復(fù)者（AR）、3個慢性解決者和6個無HBV健康對照者（HC）。流式細(xì)胞儀和組織學(xué)檢測被應(yīng)用于第二個HBV隊列進(jìn)行驗(yàn)證。基于此，作者剖析了不同HBV感染階段的協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)，為全面了解免疫發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的治療策略提供了豐富的資源。本文于2023年1月發(fā)表在《Gut》IF：24.5期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、HBV感染患者的單細(xì)胞免疫景觀
       為更好地了解HBV感染者內(nèi)部和之間的異質(zhì)性，應(yīng)用scRNA-seq來描述IT、IA、AR和CR期個體的肝內(nèi)免疫細(xì)胞以及外周血單核細(xì)胞（PBMCs）的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)（圖1A）。作為對照，對從肝移植捐贈者（HCs）那里獲得的外周血和正常肝臟組織進(jìn)行分析。詳細(xì)的臨床和病理信息，包括HBV診斷以來的時間、HBsAg水平、HBV DNA水平、ALT和AST，見表1。
經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾，獲得了23個人的243 000個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。確定了八個主要的細(xì)胞集群，包括CD4+T細(xì)胞（CD3D+CD4+）、CD8+T細(xì)胞（CD3D+CD8A+）、γδT細(xì)胞（CD3D+TRDC+）、NKT樣細(xì)胞（CD3E+KLRF1+）、NK細(xì)胞（GNLY+NKG7+）、B細(xì)胞（MZB1+CD79A+）、漿B細(xì)胞（MZB1+CD38+）和骨髓細(xì)胞（LYZ+CD14+）（圖1B）。總共確定了10個CD4+T細(xì)胞亞群，12個CD8+T細(xì)胞亞群，9個γδT細(xì)胞亞群，1個NKT樣細(xì)胞亞群，7個NK細(xì)胞亞群，7個B細(xì)胞亞群，3個漿B細(xì)胞亞群和11個髓細(xì)胞亞群（圖1B）。根據(jù)前排10差異表達(dá)基因（DEGs），確定了60個集群中每個集群的獨(dú)特標(biāo)志物（圖1C）。
       這些細(xì)胞群顯示出不同的組織來源和在疾病階段的富集（圖1D）。為研究不同疾病階段的獨(dú)特的免疫譜，分析了每個人的免疫細(xì)胞組成。發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞在IA和AR期的肝臟中都很豐富，這兩個階段的特點(diǎn)是肝臟炎癥水平升高。骨髓細(xì)胞在IT期和IA期的肝臟中顯示出優(yōu)先富集，表明在慢性HBV感染期間骨髓細(xì)胞區(qū)系發(fā)生了改變。γδT細(xì)胞和B細(xì)胞在CR期的肝臟中增加，這意味著慢性感染對這些細(xì)胞的潛在長期影響與已解決的HCV感染相似。值得注意的是，CD8+T和骨髓細(xì)胞在不同疾病階段的趨勢在肝臟和血液之間是一致的（圖1E）。這些結(jié)果表明，HBV感染者的每個疾病階段可能與一個獨(dú)特的免疫特征有關(guān)。

圖1 肝臟和血液中免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

2、HBV感染患者中Tex的擴(kuò)增和MAIT細(xì)胞的缺失
       如圖2A所示，再次聚類CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生了12個亞群。為了解CD8+T細(xì)胞群的潛在發(fā)展轉(zhuǎn)變，應(yīng)用基于分區(qū)的圖抽象（PAGA）分析來構(gòu)建12個CD8+T集群的發(fā)展軌跡。CD8T_c11-SLC4A10細(xì)胞作為一個獨(dú)特的群體在軌跡之外脫穎而出，與MAIT細(xì)胞的注釋一致。對于其他CD8+T細(xì)胞亞群，Tex（CD8T_c08-LAYN）和Temra（CD8_C03-CX3CR1）亞群被描述為兩個不同的分支（圖2B）。RNA速度分析進(jìn)一步支持了Tex和Temra的這種發(fā)展特征（圖2C）。
       此外，每個亞群都顯示出不同的組織偏好：CD8T_c01-LEF1、CD8T_c02-SELL、CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c05-GZMK-GPR183和CD8T_c09-ACTN1集群主要來自血液，而CD8T_c04-GZMK-SIRPG、 CD8T_c06_GZMK-IFNG、CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c08-LAYN、CD8T_c10-BACH2和CD8T_c11-SLC4A10集群主要存在于肝臟（圖2D，E）。12個CD8+T細(xì)胞亞群顯示出階段性的異質(zhì)性（圖2F）。在CD8+T亞群中，所有四組HBV感染者的肝臟中MAIT群體明顯減少，其中IA組最低（圖2G）。這些結(jié)果與此前的報道一致，該研究報告了HBV相關(guān)HCC患者肝臟MAIT細(xì)胞的損失。令人震驚的是，CR中的MAIT細(xì)胞比例未能恢復(fù)到HC的水平（圖2G），盡管這些患者已經(jīng)HBsAg損失超過8個月，這表明HBV感染引起的肝內(nèi)MAIT的損失是持久的。值得注意的是，CD8T_c08-LAYN細(xì)胞的比例在IT、IA和AR患者中有所增加（圖2H），其中IA患者的CD8T_c08-LAYN細(xì)胞也顯示出最高的衰竭得分（圖2H）。
       由于從scRNA-seq中捕獲了TCR序列，這使作者能夠通過以前開發(fā)的生物信息學(xué)指標(biāo)，即通過RNA測序和TCR追蹤（STARTRAC）指數(shù)來追蹤T細(xì)胞的動態(tài)，如克隆擴(kuò)張（expa）、遷移（migr）和發(fā)育過渡（tran）（圖2I）。STARTRAC-expa指數(shù)顯示，CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c08-LAYN表現(xiàn)出高度的克隆性擴(kuò)張，主要是在AR和IA階段。CD8T_c03-CX3CR1在AR患者中的擴(kuò)展程度更高，而CD8T_c08-LAYN在IA患者中的擴(kuò)展程度更高（圖2J）。STARTRAC-tran分析表明，CD8T_c08-LAYN與GZMK+亞群高度相關(guān)，包括CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c04-GZMK-SIRPG和CD8T_c06_GZMK-IFNG。與AR患者相比，IA患者的CD8T_c08-LAYN與CD8T_c06_GZMK-IFNG聯(lián)系更緊密，但與CD8T_c03-CX3CR1聯(lián)系不緊密（圖2K），表明IA和AR患者的CD8+T細(xì)胞來源不同。STARTRAC-migr分析顯示CD8T_c08-LAYN顯示中度的流動性，與腫瘤中的觀察相似。然而，與IA患者相比，AR患者的衰竭T細(xì)胞表現(xiàn)出更高的STARTRAC-migr分?jǐn)?shù)（圖2L）?？傊?，IA和AR患者的Tex細(xì)胞表現(xiàn)出動態(tài)差異。

圖2 CD8+ T細(xì)胞亞群的免疫學(xué)特征

3、IT和IA患者的肝內(nèi)調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞增加
       如圖3A所示，共鑒定了10個CD4+T細(xì)胞群。PAGA軌跡分析顯示，CD4+T細(xì)胞有四種不同的命運(yùn)，其中CD4T_c02-ANXA2、CD4T_c03-GNLY、CD4T_c04-FOXP3和CD4T_c06-TIMP1是不同的終點(diǎn)（圖3B）。朝向效應(yīng)器和調(diào)節(jié)子集的進(jìn)化方向也被RNA速度分析所證實(shí)（圖3C）。組織偏好分析顯示，CD4T_c05-CCR7、CD4T_c07-TIMP1、CD4T_c08-GZMK、CD4T_c09-CTLA4和CD4T_c10-CXCL13聚集在肝臟，其余五個亞群主要存在于血液中（圖3D，E）。
       然后比較了不同組別中CD4+T細(xì)胞（圖3F）中的CD4+T細(xì)胞亞群的分?jǐn)?shù)。在這些CD4+T亞群中，CD4T_c10-CXCL13亞群在AR患者的肝臟CD4+T細(xì)胞（圖3G）中被富集。此外，在IT和IA患者的肝臟CD4+T細(xì)胞（圖3H）中，CD4T_c09-CTLA4，也被稱為肝臟駐留調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）亞群，有所增加。此外，各階段CD4T_c09-CTLA4細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)器得分分析顯示，IT和IA患者的調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能水平很高（圖3H）。這些結(jié)果表明，Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)可能與CHB的免疫耐受和病毒持久性有關(guān)。

圖3 CD4+ T細(xì)胞亞群的免疫學(xué)特征及其與CD8+ T細(xì)胞的相互作用

4、Treg和Tex細(xì)胞之間潛在的細(xì)胞間相互作用
       使用細(xì)胞空間組織圖（CSOmap），一個推斷組織空間組織和細(xì)胞相互作用分子決定因素的生物信息學(xué)工具，作者估計了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群在計算構(gòu)建的偽空間中的細(xì)胞相互作用潛力。在IT和IA階段，發(fā)現(xiàn)Treg（CD4T_c09-CTLA4）和Tex（CD8T_c08-LAYN）之間有明顯的相互作用（圖4A）。值得注意的是，Tex和Treg在IT和IA患者的肝臟中被協(xié)調(diào)性地擴(kuò)展（圖2H）。通過多色免疫組化（IHC）染色，進(jìn)一步證實(shí)了IT和IA患者中Tex（CD8+PD-1+）和Treg（CD4+FOXP3+）細(xì)胞之間的相鄰空間關(guān)系（圖4B）。
       然后，比較了在IT和IA患者中促成Treg-CD8 Tex相互作用的潛在配體-受體（L-R）對的強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)幾個L-R對，CD44_VIM、HLA-B_CANX、TNFRSF1A_LTB和CD74_APP，在IT期顯示出較高的相互作用潛力，而HLA-A_APLP2、KLRD1_HLA和KLRD1_HLA-E在IA期顯示出較高的相互作用潛力（圖4C、D）。最近有報道說HLA-B_CANX軸能夠抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫。由VIM基因編碼的Vimentin是Treg活性的關(guān)鍵代謝和功能控制器，而CD44免疫檢查點(diǎn)控制CD8+T細(xì)胞的激活。此外，HLA-E_KLRD1信號參與介導(dǎo)慢性HBV和HCV感染的T細(xì)胞功能障礙和病毒持久性?？傊?，這些數(shù)據(jù)為今后有關(guān)免疫發(fā)病機(jī)制的研究以及CHB的治療嘗試提供了寶貴的功能驗(yàn)證信息。

圖4肝臟Treg和Tex細(xì)胞的多色免疫組化染色

5、HBV感染者的肝內(nèi)骨髓細(xì)胞及其與T細(xì)胞的相互作用
       如圖5A所示，髓細(xì)胞被聚類為11個細(xì)胞亞群，屬于四個共同的系（樹突狀細(xì)胞（DCs）、巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞）。DCs進(jìn)一步分為兩個經(jīng)典的cDC亞群（CLEC9A+cDC1和CLEC10A+cDC2），一個成熟的cDC亞群（cDC2-LAMP3），一個增殖的亞群（cDC2-MKI67）和pDC。所有這五種DC亞群都主要存在于肝臟（圖5B,C），并在IT患者中富集（圖5D,E），表明這些細(xì)胞可能是由IT患者的高水平病毒復(fù)制所驅(qū)動。巨噬細(xì)胞被進(jìn)一步分為macro_c01-C1QC、macro_c02-NLRP3和macro_c03-FCGR3A。與DCs類似，巨噬細(xì)胞亞群也主要分布在肝臟（圖5B,C）。在五個病人組中，macro_c01-C1QC和macro_c03-FCGR3A在IT病人的肝臟CD45+細(xì)胞中顯示出明顯的擴(kuò)展（圖5F）。
       為了解巨噬細(xì)胞亞群的來源，根據(jù)報道的標(biāo)記物定義了關(guān)于Kupffer來源（Kupffer score）或單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞（MoMF score）的分?jǐn)?shù)?；谂cKupffer/單核細(xì)胞來源相關(guān)的基因的表達(dá)分析并不能完全解釋巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性（圖5G）。進(jìn)一步比較巨噬細(xì)胞群體之間的DEGs發(fā)現(xiàn)，macro_c01-C1QC表達(dá)了高水平的補(bǔ)體C1Q基因和第二類HLA分子，表明該集群具有吞噬能力（圖5H）。Macro_c02-NLRP3表達(dá)高水平的促炎癥基因，如S100基因、IL1B、VCAN和LYZ，并以高促炎癥評分為特征（圖5H）。Macro_c03-FCGR3A表達(dá)高水平的抗病毒ISG（IFITM2、IFITM3、SPN、WARS和CTSC）和免疫調(diào)節(jié)基因（SOD1、MT2A、LST1、LYN、MTSS1、PECAM1、LILRB2和LILRA5），表現(xiàn)出高促炎性評分和高抑制T細(xì)胞活化的能力（圖5H）。

圖5 骨髓細(xì)胞亞群的免疫學(xué)特征及其與T細(xì)胞的相互作用

       為剖析巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的潛在串?dāng)_，使用CSOmap來推斷巨噬細(xì)胞亞群和T細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。驚人的是，CSOmap分析顯示，macro_c03-FCGR3A在兩個慢性期（IT和IA）與T細(xì)胞的相互作用中占主導(dǎo)地位，而在兩個緩解期（AR和CR）這種相互作用的強(qiáng)度下降，而macro_c02-NLRP3在解決期與T細(xì)胞的相互作用占主導(dǎo)地位（圖5I）。通過檢查macro_03-FCGR3A和CD8T_c08-LAYN之間的L-R對相互作用，HLA一類分子（HLA-I）和白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（LILR）家族之間的幾個L-R對表現(xiàn)出強(qiáng)烈的潛在相互作用（圖5J）。一致的是，觀察到在IT和IA患者的肝臟中，LILRB2陽性的巨噬細(xì)胞與Tex細(xì)胞相鄰的位置富集（圖6）。這些潛在的相互作用可能是功能性的，考慮到以前的研究結(jié)果，LILRB1和LILRB2可以通過與CD8+T細(xì)胞競爭HLA-I的結(jié)合，以及通過其免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制性受體圖案招募抑制性分子，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的免疫逃避。總之，這些結(jié)果表明，F(xiàn)CGR3A+巨噬細(xì)胞在CHB中調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)方面起著核心作用，可能是通過HLA-I_LILRB信號傳導(dǎo)。

圖6 IT組、IA組和AR組大鼠肝臟特克斯細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的多色免疫組化染色

6、肝臟免疫亞群與臨床參數(shù)的相關(guān)性
       為了解HBV感染者的肝臟免疫亞群與臨床參數(shù)的關(guān)系，對所有17名HBV感染者的細(xì)胞頻率與HBsAg、HBV DNA、ALT、AST以及組織學(xué)分級和分期的水平進(jìn)行了相關(guān)性分析。年齡和診斷后的時間也被納入分析，以撇開受這兩個參數(shù)影響的因素。有趣的是，ALT水平與MAIT細(xì)胞的頻率呈負(fù)相關(guān)，與肝臟中CD8+ Tex、Treg和CD4T_c10-CXCL13的頻率呈正相關(guān)（圖7A），表明這些細(xì)胞亞群可能是肝損傷的關(guān)鍵執(zhí)行者或反應(yīng)者。與ALT類似，觀察到MAIT細(xì)胞和CD8+ Tex與肝臟活檢的組織學(xué)分級分?jǐn)?shù)分別負(fù)相關(guān)和正相關(guān)（圖7B）。此外，組織學(xué)分級與CD8T_c05-GZMK-GPR183的頻率呈正相關(guān)，與PlasmaB_c01-SDC1和兩個骨髓亞群（cDC1和macro_c03-FCGR3A）呈負(fù)相關(guān)（圖7B）。相比之下，組織學(xué)分級僅與肝臟CD45+細(xì)胞中CD8T_c05-GZMK-GPR183的頻率呈正相關(guān)。隨后作者評估了肝內(nèi)免疫亞群與血清HBsAg和血清HBV DNA水平的關(guān)系。血清HBsAg水平與macro_c03-FCGR3A、macro_c02-NLRP3、cDC-LAMP3和cDC-MKI67的頻率成正相關(guān)（圖7C）。
       為剖析血液和肝臟之間是否存在協(xié)調(diào)的免疫變化，對17名HBV感染者的血液和肝臟之間所有確定的免疫亞群進(jìn)行了相關(guān)分析。在60個亞群中，4個亞群（CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c09-ACTN1、CD8T_c12-MKI67和plasmaB_c03-MKI67）在血液和肝臟之間顯示出明顯的相關(guān)性（圖7D）。肝內(nèi)免疫細(xì)胞亞群在不同階段有明顯改變，如MAIT、Treg和CD8+ Tex，在血液中幾乎找不到（圖7D）。值得注意的是，CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c09-ACTN1的頻率在血液和肝臟之間呈現(xiàn)正相關(guān)（圖7D）。CD8T_c03-CX3CR1（類似于Temra）和CD8T_c09-ACTN1（Tcm亞群）細(xì)胞都表現(xiàn)出類似的功能特征，包括低衰竭和高細(xì)胞毒性水平（圖7E）。通過使用額外的驗(yàn)證隊列，作者證實(shí)CX3CR1+GNLY+Tcm細(xì)胞（CD8T_c09-ACTN1細(xì)胞的潛在替代物）在AR患者的血液中優(yōu)先擴(kuò)展（圖7F）。因此，應(yīng)研究CX3CR1+GNLY+ CD8+Tcm細(xì)胞在治愈HBV中的可能作用。

圖7 HBV感染患者肝內(nèi)免疫特征與臨床參數(shù)的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)方法
臨床樣本收集和細(xì)胞分離，單細(xì)胞RNA測序和數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析，流式細(xì)胞術(shù)，多色免疫組化，
參考文獻(xiàn)
Zhang C, Li J, Cheng Y, Meng F, Song JW, Fan X, Fan H, Li J, Fu YL, Zhou MJ, Hu W, Wang SY, Fu YJ, Zhang JY, Xu RN, Shi M, Hu X, Zhang Z, Ren X, Wang FS. Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients. Gut. 2023 Jan;72(1):153-167. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325915. Epub 2022 Mar 31. PMID: 35361683; PMCID: PMC9763233.

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