帕金森病大腦的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示疾病階段特異性基因表達(dá)變化
帕金森?。≒D）是常見的僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群中有2-3%的人患病。目前還沒(méi)有有效減緩疾病進(jìn)程的治療方法，迫切需要更好地了解疾病機(jī)制以支持新療法的開發(fā)。PD的特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)變性，導(dǎo)致紋狀體多巴胺耗竭，引起靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和強(qiáng)直等癥狀。另一個(gè)神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志是在剩余神經(jīng)元和神經(jīng)元突起中分別存在路易小體（LB）和路易神經(jīng)突包涵體，主要由錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白（α-syn）聚集物組成。2003年Braak及其同事基于腦內(nèi)LB病理的特定進(jìn)展模式提出了臨床前和臨床PD病理分期系統(tǒng)。Braak LB分期范圍從1到6，反映出大腦中LB的分布越來(lái)越廣泛，呈現(xiàn)出從頭端到尾端的模式。Braak分期系統(tǒng)被認(rèn)為反映了疾病進(jìn)展，隨著疾病過(guò)程進(jìn)一步影響腦區(qū)，關(guān)鍵臨床癥狀相繼出現(xiàn)。大多數(shù)PD是散發(fā)性的，可能是由遺傳、表觀遺傳和環(huán)境之間的復(fù)雜相互作用引起的。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了90個(gè)與PD風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的基因位點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究主要在血液和死后腦組織中進(jìn)行，后者可以說(shuō)是該疾病核心病理學(xué)最具代表性。然而，以往的PD腦轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在樣本數(shù)量和所選腦區(qū)方面都受到限制。沒(méi)有研究使用神經(jīng)病理學(xué)，特別是Braak LB分期作為疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。該研究發(fā)表在《Acta Neuropathologica》，IF：12.7。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. 不同病理疾病階段個(gè)體額上回的基因表達(dá)
在該研究中，作者檢測(cè)了84個(gè)個(gè)體（包括23個(gè)非神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)照和61個(gè)在不同Braak LB分期受α-syn相關(guān)病理學(xué)影響的個(gè)體）的上額葉皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組水平的差異。后者根據(jù)Braak LB分期分為三個(gè)神經(jīng)病理組：一組由分析組織中沒(méi)有LB病理的個(gè)體組成，對(duì)應(yīng)Braak LB 1-4期,（n=19），一組由額葉皮層中度LB病理學(xué)的個(gè)體組成（Braak LB 5期，n=19），另一組由額葉皮層LB負(fù)荷較高的個(gè)體組成（Braak LB 6期，n=23）。值得注意的是，作者從額葉上皮層提取了RNA，LB在Braak LB 5期出現(xiàn)（圖1）。
圖1 研究概述
所選個(gè)體在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素（性別和死亡年齡）和阿爾茨海默?。ˋD）相關(guān)病理水平相匹配（圖2）。觀察到接受深部腦刺激手術(shù)的個(gè)體比例在兩組間有顯著差異（Braak LB 0=0/23，Braak LB 1-4=0/19，Braak LB 5=1/19，Braak LB 6=6/23，p=0.0036，卡方檢驗(yàn)）。這種差異可以用以下事實(shí)來(lái)解釋：深部腦刺激可能是較晚期特定患者的一種治療方案。組間癡呆持續(xù)時(shí)間也有差異，第5組和第6組的癡呆持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（p=0.0002，Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)）。這種差異可歸因于癡呆出現(xiàn)在疾病的晚期階段。值得注意的是，在Braak神經(jīng)原纖維纏結(jié)期、反映總AD相關(guān)病理學(xué)的復(fù)合“ABC評(píng)分”、CERAD分期或CAA類型方面，兩組間未發(fā)現(xiàn)差異，這表明伴隨的AD病理不是作者分析中的重要混雜因素。此外，所有樣本的死后延遲非常短（平均=377分鐘，標(biāo)準(zhǔn)差=135分鐘），確保了高質(zhì)量的樣本。
作者在去除核糖體RNA后進(jìn)行了RNA測(cè)序，在所有樣本中共檢測(cè)到21,615個(gè)表達(dá)的基因，包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）。
圖2 個(gè)體的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、樣本信息和病理測(cè)量
2. 細(xì)胞組成和RNA質(zhì)量
在作者的研究中，使用Scaden估計(jì)了細(xì)胞類型的比例。作者檢驗(yàn)了細(xì)胞類型比例與數(shù)據(jù)中生物學(xué)變異的潛在來(lái)源（神經(jīng)病理分組、性別、死亡時(shí)年齡、PMD和RIN）之間的Pearson相關(guān)性。神經(jīng)元的比例與其他細(xì)胞類型的比例呈顯著的抗相關(guān)（p<0.05）（圖3a）。此外，如既往研究所示，細(xì)胞類型比例與RIN值呈正相關(guān)（與神經(jīng)元比例呈正相關(guān)，與其他細(xì)胞類型比例呈負(fù)相關(guān)）（圖3a）。細(xì)胞類型比例和其他變量（神經(jīng)病理組、性別、年齡和PMD）之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)（圖3a）。然后，作者對(duì)已知的實(shí)驗(yàn)協(xié)變量（性別、死亡年齡、PMD、RIN）進(jìn)行校正，尋找神經(jīng)病理學(xué)組之間細(xì)胞類型比例的差異。在4個(gè)神經(jīng)病理組（0、1-4、5和6）中，任何細(xì)胞類型均無(wú)顯著差異（p<0.2）（圖3b）。為了證實(shí)這一結(jié)果，作者也使用標(biāo)記基因譜估計(jì)了樣本中的細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理組（0、1-4、5和6）之間任何細(xì)胞類型都沒(méi)有顯著差異（p<0.3）。
由于RNA質(zhì)量與細(xì)胞類型比例相關(guān)，而且它也被證明影響基因表達(dá)水平測(cè)定，因此作者使用質(zhì)量替代變量分析（qSVA）框架來(lái)估計(jì)RNA質(zhì)量混雜因素。采用該方法獲得的5個(gè)質(zhì)量替代變量（qSVs）與已知的與RNA質(zhì)量相關(guān)的變量（RIN和PMD）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。此外，由于作者已經(jīng)表明細(xì)胞比例與由RIN值測(cè)量的RNA質(zhì)量顯著相關(guān)，作者還檢驗(yàn)了5個(gè)qSV和細(xì)胞類型比例之間的Pearson相關(guān)性。qSV1與所分析的所有變量顯著相關(guān)。除PMD與qSV2和qSV3顯著相關(guān)外，qSV5與其他變量均顯著相關(guān)。最后，qSV4與RIN值顯著相關(guān)（圖3c）。因此，作者納入了5個(gè)質(zhì)量替代變量作為協(xié)變量，而不是使用樣本的RIN值和PMD。
圖3 細(xì)胞組成和RNA質(zhì)量
3. 不同神經(jīng)病理分期的差異基因表達(dá)
為了確定表達(dá)水平隨LB神經(jīng)病理學(xué)進(jìn)展而變化的基因組，作者對(duì)所有4個(gè)神經(jīng)病理學(xué)組的共21,615個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。性別、死亡年齡和5個(gè)qSV被用作LRT檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)協(xié)變量。原假設(shè)是基因表達(dá)在組間是穩(wěn)定的，并且檢驗(yàn)與組順序無(wú)關(guān)，這可能會(huì)檢測(cè)出任何可能的上調(diào)和下調(diào)組合的不穩(wěn)定表達(dá)模式。差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)四個(gè)神經(jīng)病理組共有266個(gè)差異表達(dá)基因（LRT檢驗(yàn)，Benjamini-Hochberg FDR<0.05），其中34個(gè)對(duì)應(yīng)于lncRNA。
為了進(jìn)一步研究這266個(gè)差異表達(dá)基因，使用DEGreport R包中的分裂層次聚類對(duì)其正則化log2轉(zhuǎn)換計(jì)數(shù)進(jìn)行聚類。差異表達(dá)基因被分為8個(gè)簇。每個(gè)簇的典型神經(jīng)病理組的表達(dá)模式，以及每個(gè)基因的縮放表達(dá)水平見圖4。
圖4 不同Braak LB分期的差異表達(dá)基因簇
簇1（30個(gè)基因）和4（25個(gè)基因）的表達(dá)分別從Braak LB 0期到6期呈線性上升和下降模式。上調(diào)基因簇（1）的命中率最高的基因是SNX7，而下調(diào)基因簇（4）的命中率最高的基因是NUCB1。所有其他的基因簇表現(xiàn)出一種表達(dá)模式，在Braak LB 1-4期和6期的樣本有相對(duì)相似的表達(dá)水平，而在Braak LB 5期的樣本與其他組相比顯示出基因表達(dá)水平的重大變化。在這些顯示主要轉(zhuǎn)錄組變化的簇中，簇2和3包含了大部分基因（分別為57和109個(gè)）。簇2中最重要的基因是PDXK，而簇3中最重要的三個(gè)基因是新的轉(zhuǎn)錄本。
4. Braak LB 0期對(duì)照和Braak LB病理組之間的兩兩差異基因表達(dá)
為了進(jìn)一步研究Braak LB 5期樣本的主要基因表達(dá)變化，作者比較了該組的轉(zhuǎn)錄組和對(duì)照組（Braak LB 0期）的轉(zhuǎn)錄組。使用Wald檢驗(yàn)對(duì)共21,615個(gè)基因進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，使用性別、死亡年齡和5個(gè)qSV作為協(xié)變量。作者發(fā)現(xiàn)在Braak LB 0期和Braak LB 5期樣本之間共有979個(gè)差異表達(dá)基因（Benjamini-Hochberg FDR<0.05），其中575個(gè)表達(dá)上調(diào)，404個(gè)表達(dá)下調(diào)。在Braak LB 5期差異表達(dá)的979個(gè)基因中，233個(gè)基因在主要分析中比較了所有Braak LB分期組的基因表達(dá)差異的266個(gè)基因中。值得注意的是，在比較0期和1-4期時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在FDR<0.05的差異表達(dá)基因，而在Braak LB 0期和6期之間有38個(gè)基因有顯著差異表達(dá)。在這38個(gè)在Braak LB 0期和6期之間有差異表達(dá)的基因中，有28個(gè)也在Braak LB 0期和5期之間的差異表達(dá)基因中。在Braak LB 5期和6期均以SNX7基因?yàn)橹?。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了在Braak LB 5期可以觀察到最顯著的額葉皮質(zhì)基因表達(dá)變化。
5. 功能富集分析
作者對(duì)每個(gè)神經(jīng)病理組（1-4、5和6）與對(duì)照組的差異基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了功能富集分析。作者納入了所有21,615個(gè)基因，并根據(jù)每次比較的p值和對(duì)數(shù)倍數(shù)變化對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行評(píng)分。通過(guò)這種方法，作者發(fā)現(xiàn)從Braak LB 0期到1-4期顯著富集了99條GO通路（FDR<0.05），從Braak LB 0到5期顯著富集了75條通路，從Braak LB 0到6期顯著富集了163條通路。作者生成了火山圖，突出了在每個(gè)Braak LB分期富集的三個(gè)最重要的通路所涉及的基因。所有通路的調(diào)控方向是由每個(gè)通路所涉及的大多數(shù)基因驅(qū)動(dòng)的。這排除了通路發(fā)現(xiàn)是由單基因表達(dá)變化驅(qū)動(dòng)的可能性。在總結(jié)GO通路時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)在Braak LB 1-4期富集的通路有29條，在Braak LB 5期富集的通路有31條（圖5），在Braak LB 6期富集的通路有39條。此外，作者發(fā)現(xiàn)在所有Braak LB分期富集的通路有12條（均為下調(diào)），這些通路主要涉及ATP代謝過(guò)程。
圖5在Braak LB 5期富集的通路
6. 風(fēng)險(xiǎn)基因
為了研究部分SNPs與PD相關(guān)的功能和分子機(jī)制，作者提取了與90個(gè)帕金森病風(fēng)險(xiǎn)SNPs最近的基因和QTL指定基因。選取的98個(gè)基因中有87個(gè)在樣本中表達(dá)。在Braak LB 0期和Braak LB 5期的差異表達(dá)基因中有5個(gè)（Benjamini-Hochberg FDR<0.05）。在Braak LB 5期的差異表達(dá)基因中，PD基因的富集沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2（1，n=21,615）=0.084，p=0.773）。為了進(jìn)一步研究這些基因，作者進(jìn)行了eQTL分析，以評(píng)估這5個(gè)基因的表達(dá)是否與附近PD風(fēng)險(xiǎn)SNP的基因型相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)rs11683001與其最近的基因MAP4K4之間存在關(guān)聯(lián)（校正后p=0.025）（圖6a）。值得注意的是，在樣本中表達(dá)的87個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因都不在Braak LB 0期和Braak LB 6期之間差異表達(dá)的基因中。
作者最近報(bào)道了與TMCC2、SFMBT2、AKAP6和PHYHIP附近的與Braak LB分期相關(guān)的差異甲基化復(fù)制位點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)所有4個(gè)基因都在樣本中表達(dá)。其中一個(gè)位于cg04011470附近的基因PHYHIP也是Braak LB 5期的差異表達(dá)基因之一（圖6b）。
圖6 風(fēng)險(xiǎn)基因
結(jié)論
綜上所述，作者對(duì)Braak LB各階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，只有當(dāng)LB首次出現(xiàn)在研究的病變組織中時(shí)，才能觀察到基因表達(dá)的主要變化，而在LB出現(xiàn)之前和之后，只有微小的變化可以檢測(cè)到。此外，作者證實(shí)了參與ATP代謝過(guò)程和突觸損傷的通路在疾病的各個(gè)階段都有富集。相反，與免疫反應(yīng)相關(guān)的通路在LB形成之前被上調(diào)，然后在疾病的后期被下調(diào)，突顯了免疫反應(yīng)是未來(lái)疾病修飾治療的可能靶點(diǎn)之一。作者還發(fā)現(xiàn)了可能參與PD發(fā)病的單個(gè)基因（SNX7，NUCB1，PDXK，PHYHIP和MAP4K4），并指出了lncRNA在疾病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。
實(shí)驗(yàn)方法
RNA測(cè)序
參考文獻(xiàn)
Cappelletti C, Henriksen SP, Geut H, Rozemuller AJM, van de Berg WDJ, Pihlstr?m L, Toft M. Transcriptomic profiling of Parkinson's disease brains reveals disease stage specific gene expression changes. Acta Neuropathol. 2023 Jun 22. doi: 10.1007/s00401-023-02597-7.