原位雜交實(shí)驗(yàn)

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原位雜交實(shí)驗(yàn)

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原位雜交（in situ hybridization, ISH）是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交可分為直接法和間接法。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法用半抗原標(biāo)記探針，通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接顯示探針與靶核酸形成的雜交體。非放射性標(biāo)記的原位雜交具有安全、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因而生物素標(biāo)記探針digaoxin標(biāo)記探針迅速發(fā)展。
標(biāo)記探針迅速發(fā)展。
1、原位雜交（digaoxin）實(shí)驗(yàn)流程

  1. 蛋白酶K處理

  2. 預(yù)雜交

  3. 探針變性

  4. 雜交

  5. 洗滌

  6. 消化殘余的RNA

  7. 封閉液封閉30min。

  8. 抗體孵育1~2h。

  9. 洗滌

  10. 顯色BCIP/NBT顯色液加至標(biāo)本上避光顯色20min。若無(wú)背景出現(xiàn)可繼續(xù)顯色過(guò)夜。

  11. 核固紅復(fù)染，充分自來(lái)水沖洗。

  12. 梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡觀察拍照。


 
2、熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)流程（FISH）
1、脫蠟
2、蛋白酶處理
3、變性
4、雜交
5、雜交后水洗
6、檢測(cè)
7、擴(kuò)增
8、DAPI封片，熒光顯微鏡拍照。


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