原位雜交實驗

原位雜交實驗

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原位雜交（in situ hybridization, ISH）是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，根據(jù)堿基互補配對原則，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測，原位雜交可分為直接法和間接法。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進行雜交，通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法用半抗原標(biāo)記探針，通過免疫組織化學(xué)法對半抗原定位，間接顯示探針與靶核酸形成的雜交體。非放射性標(biāo)記的原位雜交具有安全、經(jīng)濟、靈敏度高等優(yōu)點，因而生物素標(biāo)記探針digaoxin標(biāo)記探針迅速發(fā)展。
標(biāo)記探針迅速發(fā)展。
1、原位雜交（digaoxin）實驗流程

  1. 蛋白酶K處理

  2. 預(yù)雜交

  3. 探針變性

  4. 雜交

  5. 洗滌

  6. 消化殘余的RNA

  7. 封閉液封閉30min。

  8. 抗體孵育1~2h。

  9. 洗滌

  10. 顯色BCIP/NBT顯色液加至標(biāo)本上避光顯色20min。若無背景出現(xiàn)可繼續(xù)顯色過夜。

  11. 核固紅復(fù)染，充分自來水沖洗。

  12. 梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡觀察拍照。


 
2、熒光原位雜交實驗流程（FISH）
1、脫蠟
2、蛋白酶處理
3、變性
4、雜交
5、雜交后水洗
6、檢測
7、擴增
8、DAPI封片，熒光顯微鏡拍照。


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