activin A幫你挽救癌癥

2019年8月21日發(fā)表在J Cachexia Sarcopenia Muscle（IF=10.754）上的一篇名為“Autocrine activin A signalling in ovarian cancer cells regulates secretion of interleukin 6, autophagy, and cachexia. ”的研究揭示了激活素A信號在卵巢癌細(xì)胞中的發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制。為我們提供了一種新的研究方向。在本研究中，激活素A以自分泌方式促進(jìn)癌細(xì)胞合成和分泌IL-6。 通過抑制激活素A信號傳導(dǎo)，癌細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生減少40-50％。當(dāng)使用生物，化學(xué)和遺傳方法干擾自身痤瘡激活素A時，始終觀察到癌細(xì)胞中IL-6分泌顯著降低（P <0.05）。 抑制激活素信號傳導(dǎo)也降低了癌細(xì)胞加速非癌細(xì)胞自噬的能力（自噬通量減少高達(dá)43％，P = 0.0006）。與體外數(shù)據(jù)一致，抗體激活素受體2抗體在惡病質(zhì)荷瘤小鼠中的應(yīng)用使癌細(xì)胞衍生的IL-6的血清水平降低62％（從417到159pg / mL，P = 0.03），重要的是，它可逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)并抵消所有測量肌肉群的損失（P <0.0005）。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
一 、激活素A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌自噬促進(jìn)因子
SQSTM1特異性地被自噬靶向，并且其隨時間的依賴性下降（GFP下降/綠色熒光的喪失）是自噬活性的量度并且可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。自噬報告細(xì)胞對重組激活素A起反應(yīng)，表現(xiàn)為SMAD3磷酸化增加（圖1A）。激活素A在任何測試濃度下都沒有加速自噬（圖1A），意味著激活素A以與宿主細(xì)胞中的自噬無關(guān)的方式促成惡病質(zhì)，或者激活素A仍然可以通過影響其他自噬誘導(dǎo)因子的豐度以間接方式加速體內(nèi)自噬。TOV21G卵巢癌細(xì)胞分泌大量激活素A。激活素A通過1型和2型激活素受體啟動信號傳導(dǎo)，2型受體激活素A可以與ActRIIA和B結(jié)合。所有siRNA均有效降低其靶轉(zhuǎn)錄物水平（圖1B），并維持mRNA水平的降低轉(zhuǎn)染后至少3天。未觀察到不同siRNA對細(xì)胞增殖或存活的影響。通過ELISA測量，INHBA siRNA將TOV21G分泌的激活素A蛋白減少約90％（從平均278至32pg / mL）（圖1C）。轉(zhuǎn)染后1天已經(jīng)觀察到大約40％的自噬通量降低，并且這種作用持續(xù)至少3天（圖1D）。相比之下，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤或巴弗洛霉素A1（17h）分別將報告細(xì)胞中的自噬通量降低30％和40％（圖S2）。結(jié)果表明，盡管激活素A可能不直接激活自噬，以自分泌或旁分泌方式促進(jìn)其他自噬加速因子從細(xì)胞中分泌。

                              圖1激活了自分泌或旁分泌環(huán)的作用，以促進(jìn)從ToV21G細(xì)胞分泌自噬-加速化合物。
二、激活素A對于從癌細(xì)胞分泌自噬促進(jìn)因子IL-6是重要的
用于KRAS的兩種不同siRNA顯示有效降低了KRAS轉(zhuǎn)錄物的水平（圖2A），并且伴隨著細(xì)胞中IL-6轉(zhuǎn)錄物水平的明顯降低（圖2B）。轉(zhuǎn)染后1天CM中的IL-6蛋白從非靶向siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CM中平均23.5ng/mL降低約43％（圖2C）。在TOV21G細(xì)胞中進(jìn)行siRNA介導(dǎo)的INHBA或ACVR2A/ACVR2B的敲低。所有siRNA均導(dǎo)致CM中IL-6水平降低，如通過IL-6ELISA在第1天后測量的轉(zhuǎn)染并通過bioplex測定確認(rèn)，該效果在轉(zhuǎn)染后維持至少3天（圖3A）。激活素A中和抗體使CMs中IL-6的水平降低（圖3B），ActRIIB誘導(dǎo)受體和ALK4/5/7抑制劑使CM中的IL-6水平分別降低（圖3B）。SMAD3 siRNA有效降低了SMAD3轉(zhuǎn)錄物的水平，并顯著降低了TOV21G細(xì)胞中IL-6的分泌（圖3C和3D），顯示涉及ALK4/5/7誘導(dǎo)的SMAD3的經(jīng)典激活素A信號傳導(dǎo)對誘導(dǎo)的IL-6分泌是重要的。靶向激活素A信號傳導(dǎo)的所有siRNA均導(dǎo)致IL-6的mRNA水平降低，支持自分泌激活素A信號傳導(dǎo)促進(jìn)IL-6轉(zhuǎn)錄（圖3E）。ALK4/5/7抑制或siRNA介導(dǎo)的SMAD3敲低降低了IL-6轉(zhuǎn)錄水平（圖3F和3G）。用重組激活素A處理可以顯著抵消INHBA siRNA對IL-6轉(zhuǎn)錄物水平的影響（圖3E），證明IL-6轉(zhuǎn)錄的作用受自分泌激活素A信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。使用siRNA的激活素信號傳導(dǎo)的干擾導(dǎo)致pNF-κB水平的明顯降低（p65），證明NF-κB與p38 MAPK協(xié)同誘導(dǎo)IL-6表達(dá)（圖3H）。p38 MAPK是激活素A下游的信號傳導(dǎo)介質(zhì)之一，對激活素A信號傳導(dǎo)的干擾降低了癌細(xì)胞中p38的磷酸化水平（圖3I）。這些數(shù)據(jù)表明p38MAPK和NF-κB在激活素A誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生中起作用。

                                        圖2 KRAS影響TOV21G細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6的分泌。

                                    圖 3 激活素A 影響 TOV21 G 細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞因子 IL-6 的分泌。

三、干擾激活素A信號傳導(dǎo)減少血清中腫瘤衍生的IL-6并逆轉(zhuǎn)小鼠的惡病質(zhì)
攜帶TOV21G腫瘤的小鼠迅速形成惡病質(zhì)，明顯表現(xiàn)為體重減輕，肌肉（脛骨肌，腓腸肌復(fù)合體，股四頭肌和心臟）和白色脂肪組織（圖4A-4I）。CDD866治療明顯逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)，小鼠體重增加，心臟和肌肉質(zhì)量甚至達(dá)到超過非荷瘤小鼠的體重和肌肉質(zhì)量的程度（圖4A-4F）。CDD866治療也導(dǎo)致腫瘤大小減小（圖4G和4H），CDD866處理的小鼠減少了白色脂肪組織的損失，但并不顯著（P = 0.06）（圖4I）。攜帶TOV21G的小鼠具有增加的激活素A的血清水平，并且在CDD866處理后檢測到血清激活素A的額外增加（圖4J）。使用物種特異性ELISA發(fā)現(xiàn)攜帶腫瘤的小鼠的血清IL-6水平大量升高，這些血清IL-6來自癌細(xì)胞（人類IL-6）（圖4K），宿主來源的鼠IL-6增加（圖4L）。抑制ActRII導(dǎo)致攜帶腫瘤的小鼠血清中癌癥來源的人IL-6顯著減少（圖4K）。盡管血清中小鼠IL-6水平增加，但用ActRII中和抗體治療并未顯著減少IL-6庫（圖4L）?？傊茐哪[瘤中的激活素A信號傳導(dǎo)降低了腫瘤來源的IL-6的全身豐度并且與小鼠惡病質(zhì)的逆轉(zhuǎn)一致。

                                   圖4激活素A信號干擾降低血清中腫瘤源性IL-6，逆轉(zhuǎn)小鼠惡病質(zhì)。
四、人卵巢腫瘤中INHBA與IL-6基因表達(dá)的關(guān)系
發(fā)現(xiàn)體外和在TOV21G小鼠惡病質(zhì)模型中釋放IL-6需要激活素信號傳導(dǎo)。通過使用cBioPortal網(wǎng)站評估來自卵巢癌患者（n = 307）的腫瘤活組織檢查中編碼IL-6和INHBA的轉(zhuǎn)錄物水平，研究了人卵巢癌患者中激活素A和IL-6之間可能的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)之間存在顯著關(guān)聯(lián)（圖5），表明激活素A還可以調(diào)節(jié)人腫瘤中IL-6的表達(dá)。

                                        圖 5 人卵巢腫瘤中 IN HBA 與 IL-6 基因表達(dá)的關(guān)系。

結(jié)論：
該研究證實了激活素A和IL-6信號傳導(dǎo)途徑之間的功能性聯(lián)系，并表明干擾激活素A誘導(dǎo)的腫瘤IL-6分泌具有癌癥誘導(dǎo)的惡病質(zhì)的治療潛力。