染色質(zhì)定向蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的前列腺癌細(xì)胞內(nèi)源性雄激素受體網(wǎng)絡(luò)

雄激素和雄激素受體(AR)是激素激活轉(zhuǎn)錄因子(TF)，是驅(qū)動(dòng)前列腺癌(PCa)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此AR是晚期PCa激素治療的主要分子靶點(diǎn)。雄激素剝奪療法，特別是第二代抗雄激素和雄激素合成抑制劑最初是有效的。然而，由于患者仍然可以從晚期PCa進(jìn)展到致命性去勢(shì)抗性前列腺癌(CRPC)，需要新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。靶蛋白的一個(gè)來(lái)源可能是ar相關(guān)的染色質(zhì)蛋白。

大多數(shù)目前已知的核受體(NR)相互作用蛋白，包括那些AR，已經(jīng)通過(guò)遺傳篩選，如雙雜交系統(tǒng)，免疫共沉淀和基于肽段的體外方法。盡管親和純化-質(zhì)譜耦合(MS)已經(jīng)啟發(fā)了NRs的輔助調(diào)節(jié)器，但它很少在代表NRs自然環(huán)境的條件下進(jìn)行。然而，通過(guò)利用RIME(內(nèi)源性蛋白快速免疫沉淀MS)， Paltoglou等人和Stelloo等人已經(jīng)從PCa細(xì)胞交聯(lián)染色質(zhì)中鑒定了幾種內(nèi)源性AR相關(guān)蛋白。

核心調(diào)節(jié)因子通常作為蛋白質(zhì)復(fù)合物中的亞基存在，并以多種方式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，例如通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物BRG1-或brm相關(guān)的染色質(zhì)重塑復(fù)合物(BAF, SWI/SNF)改變了癌細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀。該復(fù)合物是細(xì)胞周期和增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是前列腺癌的驅(qū)動(dòng)因子，具有多種癌癥特異性作用。此外，頻繁發(fā)生的TMPRSS2-ERG融合基因易位可使BAF復(fù)合物重新靶向于染色質(zhì)，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。互斥的ATPase亞基BRG1 (SMARCA4)和BRM (SMARCA2)是復(fù)雜功能的關(guān)鍵組件。此外，AR與DNA序列特異性轉(zhuǎn)錄因子(如FOXA1、GATA2、ERG和HOXB13)之間的合作已經(jīng)建立。TF FOXA1可以結(jié)合到封閉的染色質(zhì)區(qū)域，調(diào)節(jié)其染色質(zhì)可及性，從而促進(jìn)AR結(jié)合染色質(zhì)引發(fā)PCa。

2021年6月，在Oncogene雜志上發(fā)表了文章“Chromatin-directed proteomics-identified network of endogenous androgen receptor in prostate cancer cells..”。此報(bào)道通過(guò)運(yùn)用了一種強(qiáng)大的染色質(zhì)導(dǎo)向蛋白質(zhì)組學(xué)方法，稱(chēng)為ChIP-SICAP，揭示去勢(shì)抗性前列腺癌(CRPC)細(xì)胞中內(nèi)源性AR周?chē)旧|(zhì)蛋白網(wǎng)絡(luò)(染色質(zhì)蛋白網(wǎng)絡(luò))的組成。在CRPC細(xì)胞雄激素信號(hào)通路的背景下，進(jìn)一步研究了與AR相關(guān)蛋白作用的染色質(zhì)重塑者SMARCA4和SIM2。通過(guò)整合ChIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq和功能實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，揭示SMARCA4和AR在染色質(zhì)上廣泛共存，SMARCA4缺失影響了一組AR靶基因的染色質(zhì)可及性和表達(dá)，也抑制了CRPC細(xì)胞的生長(zhǎng)，驗(yàn)證了SMARCA4在CRPC細(xì)胞中的功能。雖然SIM2的沉默同樣降低了染色質(zhì)的可及性，但它影響了更多的雄激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在雞胚絨膜尿囊膜實(shí)驗(yàn)中，SIM2沉默也降低了CRPC細(xì)胞的增殖和腫瘤的大小。總之，此研究鑒定的AR染色體是研究這一重要藥物靶點(diǎn)的重要資源。
技術(shù)路線：

一、CRPC細(xì)胞中AR的染色體

散點(diǎn)圖顯示在VCaP細(xì)胞的兩個(gè)生物重復(fù)中由AR ChIP-SICAP鑒定的染色質(zhì)相關(guān)蛋白。在暴露于R1881(合成AR激動(dòng)劑）中使用差異的silac標(biāo)記。在190個(gè)ChIP-SICAP定量蛋白中，87個(gè)形成了r1881誘導(dǎo)的AR染色體，從而發(fā)現(xiàn)了可能與受體功能相互作用的蛋白。r1881誘導(dǎo)的AR chromatome被分為不同的功能蛋白組(圖1b)。DNA和rna結(jié)合蛋白，組蛋白，DNA修復(fù)和mRNA加工相關(guān)蛋白形成了大部分(~50%)的網(wǎng)絡(luò)。
二、SMARCA4共占據(jù)了大多數(shù)ar結(jié)合位點(diǎn)，但對(duì)其染色質(zhì)可及性的影響有限

SMARCA4和AR共同占據(jù)的位點(diǎn)，以及雄激素如何影響共同占據(jù)。SMARCA4(61534)的大多數(shù)染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有受到DHT的影響(簇C1，圖2a），在C2位點(diǎn)，AR和SMARCA4與結(jié)合高度相關(guān)。DHT增強(qiáng)了SMARCA4在這些位點(diǎn)的招募(集群C1，圖2b)。基序分析顯示，與C1位點(diǎn)相比，C2位點(diǎn)具有更高的雄激素響應(yīng)元件(AREs)富集，進(jìn)一步支持雄激素誘導(dǎo)的SMARCA4到染色質(zhì)上的募集。FOXA1、ERG和HOXB13的基序依次在C1和C2位點(diǎn)上同樣富集(圖2c)。ChIP-seq數(shù)據(jù)集顯示，FOXA1和ERG的結(jié)合隨著激素暴露在C2位點(diǎn)而增加，而在C1位點(diǎn)則不增加(圖2d和e)。然而，HOXB13似乎在C1位點(diǎn)結(jié)合更多(圖2f)。與SMARCA4類(lèi)似，SMARCC1[15](在ChIP-SICAP中發(fā)現(xiàn))顯示與C1和C2位點(diǎn)相結(jié)合(圖2g）。

重點(diǎn)分析了ARBs染色質(zhì)可及性的變化，發(fā)現(xiàn)雄激素通常增加了ARBs的可及性(圖3a, ATAC, siCTRL)。盡管SBs和ARBs之間有很大的重疊，但SMARCA4刪除僅減少了2149個(gè)ARBs的染色質(zhì)可及性。這些sismarca4受影響的位點(diǎn)中有一半是開(kāi)放的，不管激素暴露與否(pre-accessible)，其余的在激素暴露后顯示其可及性增加(de novo位點(diǎn)，圖3a和c)。被AR招募的SMARCA4增加染色質(zhì)可及性，潛在地協(xié)助其他因素招募到這些位點(diǎn)(圖3d，補(bǔ)充表2)。由于雄激素誘導(dǎo)了FOXA1在sismarca4影響位點(diǎn)的結(jié)合(圖3e)， AR誘導(dǎo)的SMARCA4的招募可能有助于雄激素誘導(dǎo)FOXA1的結(jié)合。上述結(jié)果表明SMARCA4在CRPC細(xì)胞染色質(zhì)景觀的調(diào)節(jié)中既有AR依賴的作用，也有非ARr獨(dú)立的作用。
三、SMARCA4調(diào)節(jié)AR靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞粘附

使用RNA-seq研究了SMARCA4缺失對(duì)有DHT和沒(méi)有DHT的VCaP細(xì)胞基因表達(dá)的全基因組影響。后一組中，雄激素(A)下調(diào)的基因占大多數(shù)(~70%)，而在前一組中，雄激素(A)下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量增加大致相等(圖4a) 。與具有DHT的siCTRL相比，siSMARCA4有931個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中363個(gè)基因雄激素顯著調(diào)控(圖4b, c）。對(duì)差異雄激素調(diào)節(jié)基因集進(jìn)行metasscape分析。耗盡SMARCA4可增加雄激素應(yīng)答基因的表達(dá)，例如，分支結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生和參與分化的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生，而耗盡SMARCA4可抑制嘌呤代謝和細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)中富集的基因的表達(dá)(圖4d)。上述結(jié)果表明smarca4介導(dǎo)的染色質(zhì)可及性變化促進(jìn)了它們的表達(dá)。

使用測(cè)量細(xì)胞一致性的活細(xì)胞成像作為細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散的代理，來(lái)測(cè)試SMARCA4消耗的影響是否轉(zhuǎn)化為VCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的改變。如圖5所示，在沒(méi)有雄激素的情況下，SMARCA4刪除并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在有雄激素的情況下，它降低了細(xì)胞的相對(duì)融合，盡管程度低于去除AR。SMARCA4刪除同樣會(huì)降低LNCaP細(xì)胞的相對(duì)融合。
四、SIM2沉默改變了arb亞群的染色質(zhì)可及性

SIM2沉默降低了2434個(gè)arb染色質(zhì)可及性，三分之二受siSIM2影響的arb在雄激素暴露前可及(圖6a c中可獲得)，而其余在雄激素暴露后可及(圖6a c中重新獲得)。根據(jù)ChIP-SICAP數(shù)據(jù)，siim2受影響的位點(diǎn)中最富集的motif是ARE，盡管其在這些位點(diǎn)的富集程度低于未受siim2影響的位點(diǎn)(NC位點(diǎn)，圖6d）。AR、FOXA1、ERG和HOXB13在sisim2影響的位點(diǎn)的標(biāo)簽密度與NC位點(diǎn)相比均呈上升趨勢(shì)(圖6e)，表明SIM2是一種與AR協(xié)同的TF。

SIM2是否也影響AR與染色質(zhì)的結(jié)合，我們?cè)?/span>SIM2沉默后進(jìn)行AR ChIP-seq。如圖7所示，受體與大多數(shù)arb的結(jié)合沒(méi)有改變。然而,SIM2沉默影響2265 ARBs藥物通過(guò)降低和增加染色質(zhì)占用大約相同數(shù)量的地點(diǎn)(圖7 a、b)。當(dāng)反映這些siSIM2-affected染色質(zhì)易訪問(wèn)性的變化,有趣的是,減少可訪問(wèn)性是在690年siSIM2-DN ARBs藥物(圖7 c、e、f),而在siSIM2-UP arb中，染色質(zhì)可及性的變化不明顯(圖7c)。其余的(1744)siSIM2位點(diǎn)在AR結(jié)合方面沒(méi)有變化。大多數(shù)由SIM2沉默改變的arb并不與FOXA1缺失改變的arb重疊，這得到了基元分析的支持，表明FOXA1基元在siSIM2-DN arb上的富集少于在AR結(jié)合沒(méi)有變化的位點(diǎn)上的富集(圖7d）。
五、SIM2對(duì)ar介導(dǎo)的基因表達(dá)有顯著影響

利用RNAseq研究SIM2沉默后SIM2對(duì)基因表達(dá)的影響。沉默SIM2使dht調(diào)控的基因數(shù)量增加了一倍多，2394個(gè)基因受到雄激素調(diào)控，而只有180個(gè)基因受到雄激素調(diào)控(圖8a, b)。此外，沉默SIM2導(dǎo)致6867個(gè)deg，其中2937個(gè)deg受到雄激素調(diào)控(圖8c, d, Supplementary Fig. S19f)。SIM2沉默也減輕了雄激素對(duì)AR表達(dá)的抑制(補(bǔ)充圖S20)。根據(jù)RT-qPCR的評(píng)估，ARNT沉默實(shí)質(zhì)上再現(xiàn)了SIM2對(duì)選定AR靶基因和DEGs的影響(補(bǔ)充圖S21a, b)。對(duì)雄激素調(diào)節(jié)基因集的meta分析顯示，通過(guò)SIM2沉默，幾種途徑顯著富集。A_up/ siSIM2_up基因組和A_up/siSIM2_dn基因組中富集的最上面的通路分別是膜運(yùn)輸和細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)(圖8e）。