助紂為虐的外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移

巨噬細(xì)胞的差異激活與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，而表觀遺傳因子賴氨酸去甲基化酶6B (KDM6B，先前命名為JMJD3)通過(guò)一種未知的機(jī)制調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化。本文探討了該調(diào)解機(jī)制及其功能，并于2021年5月發(fā)表在《Theranostics》IF:8.579期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、巨噬細(xì)胞KDM6B的表達(dá)被miR-138-5p抑制

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道KDM6B是巨噬細(xì)胞的激活的關(guān)鍵分子，因此，作者首先檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞系MB-MDA-231對(duì)巨噬細(xì)胞系TPH-1中KDM6B表達(dá)的影響，結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基都可顯著下調(diào)KDM6B的表達(dá)，表明存在一種乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的分泌因子產(chǎn)生此種影響。因此，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了KDM6B結(jié)合的miRNA，以及結(jié)合文獻(xiàn)，通過(guò)在乳腺癌中上調(diào)的，同時(shí)符合條件的有3個(gè)。隨后將乳腺癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)三個(gè)miRNA的表達(dá)，如圖1B所示，只有miR-138-5p和miR-146a的表達(dá)在共培養(yǎng)后顯著上調(diào)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有miR-138-5p處理后KDM6B的表達(dá)顯著下降而非miR-146a（圖1C-D）。生信分析預(yù)測(cè)了miR-138-5p和KDM6B的結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)行了熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，證實(shí)了兩者間存在結(jié)合關(guān)系。

圖1 miR-138-5p抑制巨噬細(xì)胞KDM6B的表達(dá)

2、miR-138-5p介導(dǎo)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞KDM6B表達(dá)抑制

構(gòu)建了miR-138-5p過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，取其培養(yǎng)基與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果巨噬細(xì)胞中miR-138-5p表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)KDM6B的表達(dá)顯著下降。證實(shí)miR-138-5p介導(dǎo)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞KDM6B表達(dá)抑制。

圖2 miR-138-5p介導(dǎo)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞KDM6B表達(dá)抑制

3、癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-138-5p下調(diào)KDM6B的表達(dá)

隨后為了判定上述巨噬細(xì)胞中miR-138-5p表達(dá)上調(diào)的原因，檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中原代(pri-)和前體(pre-) miR-138的水平。結(jié)果顯示共培養(yǎng)和對(duì)照組間原代和前體miR-138的水平?jīng)]有差異，表明miR-138-5p是外源供應(yīng)的（圖1A）。此外，使用RNase A處理miR-138-5p水平不變，使用Triton X-100其水平顯著下降。提示miR-138-5p被膜狀結(jié)構(gòu)包裹（圖1B）。進(jìn)一步分析表明使用外泌體抑制劑GW4869處理組和外泌體刪除組的培養(yǎng)基中miR-138-5p的表達(dá)顯著下降（圖1C）。表明外泌體來(lái)源于乳腺癌細(xì)胞。類似的，外泌體抑制劑GW4869處理導(dǎo)致共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中miR-138-5p的水平顯著下降，而KDM6B的水平顯著上升（圖1D-E）。乳腺癌細(xì)胞外泌體增加TPH-1細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)但抑制KDM6B的表達(dá)，但這種作用被miR-138-5p抑制劑處理廢除（圖3F-G）。轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic的乳腺癌細(xì)胞增加了外泌體miR-138-5p的水平（圖3H）。過(guò)表達(dá)miR-138-5p的乳腺癌細(xì)胞外泌體增加了miR-138-5p水平，抑制了THP-1細(xì)胞中KDM6B的表達(dá)（圖3I-J）。總之，這些結(jié)果表明，癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-138-5p被傳遞到巨噬細(xì)胞中，并抑制KDM6B。

圖3 癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-138-5p下調(diào)KDM6B的表達(dá)

4、外泌體miR-138-5p通過(guò)抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化

隨后，作者研究了在不同培養(yǎng)條件下TPH-1的表達(dá)譜。首先，和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)抑制了M1相關(guān)基因的表達(dá)，IL-6，TNF-α，和IL-1β，但是增加了M2相關(guān)基因的表達(dá)CD163，Arg-1，IL-10,TGF-β和VEGFA。過(guò)表達(dá)KDM6B部分抑制了上述表現(xiàn)改變（圖4A-B）。流式檢測(cè)顯示乳腺癌細(xì)胞和TPH-1的共培養(yǎng)增加了CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例，但是過(guò)表達(dá)KDM6N可以抑制這種效果（圖6C）。類似的，過(guò)表達(dá)KDM6B抑制了miR-138-5p誘導(dǎo)的M2極化（圖4D-F）。與對(duì)照組相比，乳腺癌來(lái)源的外泌體miR-138-5p降低了M1相關(guān)表型，相反，M2標(biāo)志物增加并伴隨著CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增加（圖6G-I）。用從乳腺癌細(xì)胞中分離出來(lái)的外泌體處理THP-1細(xì)胞導(dǎo)致了M2極化，抑制miR-138-5p的表達(dá)可挽救這種極化（圖4J-L）?？傊?，這些結(jié)果表明外泌體miR-138-5p通過(guò)抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。

圖4 外泌體miR-138-5p通過(guò)抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化

5、KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相關(guān)基因的表達(dá)

抑制KDM6B的組蛋白去甲基化酶活性可抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)來(lái)分析M1靶基因的啟動(dòng)子活性。KDM6B的過(guò)表達(dá)特異性地刺激了促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α編碼基因的啟動(dòng)子活性（圖5A）。相反，沉默KDM6B活性則導(dǎo)致他們的啟動(dòng)子活性抑制，而過(guò)表達(dá)KDM6B降低了H3K27me3的水平（圖5B）。ChIP檢測(cè)顯示，與對(duì)照相比，THP-1細(xì)胞中KDM6B的過(guò)表達(dá)或敲除顯著增加或減少了KDM6B啟動(dòng)子在不同區(qū)域的占用(圖5C-D)。與此結(jié)果一致，啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的募集會(huì)降低或增加當(dāng)KDM6B過(guò)表達(dá)或沉默時(shí)（圖5E-F）?？傊?，下調(diào)KDM6B可提高H3K27me3水平和促炎因子編碼基因的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致抑制M1極化。

圖5 KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相關(guān)基因的表達(dá)

6、外泌體miR-138-5p促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

極化的巨噬細(xì)胞在決定腫瘤細(xì)胞的表型中起著重要的作用。因此，探究M2巨噬細(xì)胞外泌體miR-138-5p處理是否有助于乳腺癌小鼠異腫瘤模型的腫瘤轉(zhuǎn)移。使用氯膦酸鈉清除小鼠巨噬細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移使用過(guò)表達(dá)miR-138-5p的T47D或T47D細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理的Raw264.7細(xì)胞。小鼠模型通過(guò)尾靜脈注射4T1-熒光素酶細(xì)胞構(gòu)建（圖6A）。結(jié)果顯示，外泌體miR-138-5p處理組顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤體積和肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)增加了CD206和Arg-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（圖6B-E）。這些結(jié)果表明外泌體miR-138-5p誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。

圖6 外泌體miR-138-5p促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

參考文獻(xiàn)：

Xun Jing., Du Lingfang., Gao Ruifang., Shen Long., Wang Dekun., Kang Lichun., Chen Chuan'ai., Zhang Zhujun., Zhang Yuying., Yue Shijing., Feng Shuxin., Xiang Rong., Mi Xue., Tan Xiaoyue.(2021). Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics, 11(14), 6847-6859. doi:10.7150/thno.51864