circACTN4與FUBP1相互作用通過調(diào)節(jié)原癌基因MYC的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展

乳腺癌是世界上女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。2018年全球新診斷乳腺癌約210萬例，約占所有女性惡性腫瘤病例的25%。環(huán)狀RNA（circRNA）是近年來在各種物種中廣泛發(fā)現(xiàn)的一類新RNA。由于共價(jià)環(huán)結(jié)構(gòu)，circRNA 對 RNA 核酸外切酶具有抗性，并且比線性 RNA 更穩(wěn)定。今天我們講一篇關(guān)于circRNA與乳腺癌的文章，題名為：The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC。該文章發(fā)表在Molecular Cancer期刊上，IF=27.401。

USF2促進(jìn)circACTN4在BC中的表達(dá)

為了研究 circRNA 在 BC發(fā)展中的功能，利用芯片分析檢測了4對BC組織和癌旁組織中circRNA表達(dá)特征。共發(fā)現(xiàn)85個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNAs， 63 個(gè)上調(diào)和22個(gè)下調(diào)circRNAs。熱圖顯示了14個(gè)上調(diào)的circRNA，其中circACTN4是失調(diào)最嚴(yán)重的一個(gè)，差異高達(dá)10倍。根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)circACTN4來自位于人類19號染色體上的ACTN4基因，產(chǎn)生于ACTN4外顯子2至外顯子7（共571bp），通過 Sanger 測序驗(yàn)證了反向剪接連接點(diǎn)。為了驗(yàn)證circACTN4的環(huán)形結(jié)構(gòu)，使用聚斂引物和發(fā)散引物擴(kuò)增環(huán)狀 circACTN4 和線性 ACTN4。通過FISH和核質(zhì)分離PCR觀察到circACTN4主要位于BC細(xì)胞的細(xì)胞核中， circACTN4在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。，放線菌素D處理后的 qRT-PCR 和 RT-PCR 分析表明，circACTN4 在指定的時(shí)間點(diǎn)具有抗性。隨后，生物信息學(xué)預(yù)測上游轉(zhuǎn)錄因子2(USF2)可能與ACTN4的啟動(dòng)子結(jié)合。因此，構(gòu)建了攜帶全長野生型和突變型ACTN4啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體，結(jié)果表明USF2增強(qiáng)了熒光素酶野生型熒光素酶報(bào)告基因的活性。Chip-qPCR檢測進(jìn)一步證明USF2可以與ACTN4基因啟動(dòng)子結(jié)合并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了USF2過表達(dá)和敲低質(zhì)粒，通過qRT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒的BC細(xì)胞中ACTN4的表達(dá)。結(jié)果表明，上調(diào)的 USF2 顯著增加了線性ACTN4和circACTN4的表達(dá)，而下調(diào)的USF2顯著降低了線性ACTN4和circACTN4的水平。這些結(jié)果表明ACTN4是轉(zhuǎn)錄因子USF2的靶基因。

circACTN4 在 BC 組織和細(xì)胞中高度表達(dá)并與臨床病理特征相關(guān)

為探討circACTN4的表達(dá)及其臨床意義，qRT-PCR檢測80對BC組織及鄰近非腫瘤組織中circACTN4的表達(dá)。circACTN4在BC組織中的表達(dá)顯著高于配對的癌旁組織。qRT-PCR檢測20對BC和癌旁組織中線性ACTN4的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示線性ACTN4在BC組織中高表達(dá)。Pearson相關(guān)分析顯示circACTN4的水平與BC組織中線性ACTN4的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)果表明 circACTN4 和 ACTN4 的共過表達(dá)協(xié)同促進(jìn)了乳腺癌的進(jìn)展。RO曲線分析，circACTN4的AUC（曲線下面積）為0.719，診斷特異性和敏感性分別為70%和70。circACTN4 在 BC 細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞 MCF-10A。接下來，評估circACTN4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。circACTN4的表達(dá)與年齡（P ?= 0.036）、T（P ?= 0.001）、N（P ?= 0.001）和TNM分期（P < 0.001）呈正相關(guān)，但與分級無關(guān)。利用ISH檢測包含240個(gè) BC組織的組織芯片確定circACTN4的表達(dá)。Kaplan-Meier生存分析顯示，circACTN4高表達(dá)患者的總生存期比circACTN4低表達(dá)患者的總生存期短。circACTN4的表達(dá)與T分期、N分期和TNM分期呈正相關(guān)。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估 circACTN4 的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示circACTN4的過表達(dá)是BC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因子（HR = 4.566，P <0.001）。circACTN4 可以發(fā)揮致癌作用，circACTN4 的高表達(dá)可以預(yù)測 BC 患者的不良預(yù)后。

circACTN4促進(jìn)BC細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

為了探索 circACTN4 在 BC 細(xì)胞中的生物學(xué)功能，將circACTN4過表達(dá)質(zhì)粒和circACTN4的siRNA轉(zhuǎn)染到BC細(xì)胞中。qRT-PCR驗(yàn)證敲低過表達(dá)效率及不影響ACTN4線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。集落形成、EdU和CCK-8檢測表明 circACTN4的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了BC細(xì)胞的增殖能力，而circACTN4的敲低顯著抑制了細(xì)胞活力。hoechst 33342染色顯示，轉(zhuǎn)染si-circACTN4后，BC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)特征，包括熒光更強(qiáng)、核片段、染色質(zhì)聚集和凋亡小體。使用AnnexinV/PI染色通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明circACTN4敲低可以誘導(dǎo)BC的細(xì)胞凋亡。WB結(jié)果顯示，circACTN4 的下調(diào)導(dǎo)致更高水平的caspase-3和Bax以及更低的Bcl-2表達(dá)。

circACTN4 增加遷移和侵襲并調(diào)節(jié) BC 細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程

為了進(jìn)一步評估 circACTN4在BC進(jìn)展中的作用，在 circACTN4 過表達(dá)或敲低后研究了 BC 細(xì)胞的遷移、侵襲和細(xì)胞周期。劃痕和transwell試驗(yàn)表明，BC細(xì)胞的侵襲和遷移能力因 circACTN4 的上調(diào)而顯著增加，但被 circACTN4 的下調(diào)顯著抑制。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或敲低BC細(xì)胞中MMP9和MMP2蛋白水平明顯升高或降低，nm23-H1表達(dá)明顯降低或升高。式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示與對照組相比，circACTN4的敲低導(dǎo)致S期BC細(xì)胞比例較低，G1期BC細(xì)胞比例較高，這表明circACTN4沉默導(dǎo)致G1期阻滯BC 細(xì)胞。此外，WB顯示BC 細(xì)胞中敲低 circACTN4 后，CDK4、CCNE1 和 CCND1 蛋白水平顯著下調(diào)，這可能阻止了 BC 細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。

CircACTN4 直接與 FUBP1 相互作用并激活 MYC 的轉(zhuǎn)錄

為了探索circACTN4的分子機(jī)制，首先進(jìn)行了pull down和質(zhì)譜分析circACTN4結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)FUBP1在circACTN4上顯著富集。RIP 檢測進(jìn)一步證實(shí) FUBP1 可以通過qRT-PCR與BC細(xì)胞中的內(nèi)源性circACTN4 特異性結(jié)合。FISH-IF 分析顯示 circACTN4和FUBP1共定位于細(xì)胞核中。但是circACTN4 的上調(diào)和敲低并沒有改變 FUBP1的表達(dá)水平，表明circACTN4不參與FUBP1的翻譯后調(diào)控。ChIP-PCR測定證實(shí)FUBP1與BC細(xì)胞中MYC啟動(dòng)子結(jié)合。構(gòu)建了 FUBP1 和 FIR 過表達(dá)和敲低質(zhì)粒。通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡確定轉(zhuǎn)染效率。qRT-PCR和WB的結(jié)果表明，FUBP1的上調(diào)或下調(diào)分別顯著增加或降低了BC細(xì)胞中MYC的表達(dá)水平。此外， qRT-PCR發(fā)現(xiàn)FUBP1在BC組織中的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織中的表達(dá)。Pearson相關(guān)分析表明circACTN4的水平與BC組織中FUBP1的表達(dá)呈正相關(guān)。此外，MYC在BC組織中高表達(dá)，并與 FUBP1的表達(dá)呈正相關(guān)。為了確認(rèn)ACTN4在BC中的生物學(xué)功能，構(gòu)建了ACTN4過表達(dá)和干擾質(zhì)粒，為了探究 circACTN4 的作用與 ACTN4 無關(guān)，進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明 ACTN4 敲低不影響促進(jìn)作用circACTN4 對 MYC 轉(zhuǎn)錄的過度表達(dá)，ACTN4 的上調(diào)并沒有逆轉(zhuǎn) qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡對 circACTN4 敲低對 MYC 表達(dá)的抑制作用。WB結(jié)果表明circACTN4可以促進(jìn)MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明 circACTN4 可以與 FUBP1 結(jié)合并促進(jìn) MYC 的表達(dá)。

circACTN4 和 FIR 與 FUBP1 競爭結(jié)合

推測circACTN4可以與FUBP1競爭性結(jié)合并阻止FIR與FUBP1結(jié)合以促進(jìn) MYC的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證提出的假設(shè)，qRT-PCR檢測了BC和匹配組織中FIR的表達(dá)，與正常相鄰組織相比，BC組織中FIR的表達(dá)顯著下調(diào)。Pearson相關(guān)分析表明，FIR的表達(dá)與BC組織中circACTN4、FUBP1和MYC的水平呈負(fù)相關(guān)。免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明，在過表達(dá)circACTN4的BC細(xì)胞的FUBP1-共免疫共沉淀物中未發(fā)現(xiàn)明顯的FIR蛋白帶，而在circACTN4被敲低后，通過蛋白質(zhì)印跡在共免疫共沉淀物中明顯檢測到FIR，這表明上調(diào)的circACTN4顯著削弱FIR與 FUBP1的結(jié)合，同時(shí)下調(diào) circACTN4 顯著加強(qiáng)了 FUBP1 和 FIR 之間的相互作用。ChIP分析結(jié)果表明，高濃度si-circ#2轉(zhuǎn)染后FIR和FUSE的結(jié)合水平高于低濃度si-circ#2轉(zhuǎn)染后FIR和FUSE的結(jié)合水平。此外，沉默 FIR 顯著增強(qiáng)了 MYC 的表達(dá)，而過表達(dá) FIR 通過 qRT-PCR 和 BC 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)印跡降低了 MYC 的水平。OE-FIR 或 sh-FIR 與 circACTN4 或 si-circ#2 共轉(zhuǎn)染后，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá) FIR 可以逆轉(zhuǎn) circACTN4 對 MYC 表達(dá)的增強(qiáng)作用，而 FIR 敲低可以抵消下調(diào)的抑制作用qRT-PCR 在 MYC 水平上檢測到 circACTN4?？傊?，這些結(jié)果表明circACTN4可以抑制FIR和FUBP1的結(jié)合以減輕FIR的抑制作用，從而促進(jìn)MYC轉(zhuǎn)錄。

FIR 逆轉(zhuǎn) circACTN4 在 BC 細(xì)胞中的腫瘤促進(jìn)作用

為了進(jìn)一步研究 circACTN4 是否通過 circACTN4/FUBP1/MYC 軸發(fā)揮其生物學(xué)作用，在 OE-FIR 或 sh-FIR 與circACTN4或si-circ#2 共轉(zhuǎn)染后，在 BC 細(xì)胞中進(jìn)行了一系列拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，FIR 過表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn) circACTN4 上調(diào)在 BC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的促進(jìn)作用，而 FIR 敲低通過傷口愈合、EdU 和 transwell 測定減弱了 BC 細(xì)胞中 circACTN4 下調(diào)介導(dǎo)的抑制作用。此外，IF 分析還表明 FIR 過表達(dá)和敲低可以明顯逆轉(zhuǎn) circACTN4 上調(diào)和下調(diào)對 MYC 表達(dá)的影響。IF發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，在BC 組織中 MYC 高表達(dá)。WB分析表明，FIR的上調(diào)和下調(diào)可以通過過表達(dá)和沉默circACTN4來抵消對MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表達(dá)的增強(qiáng)和抑制作用。綜上所述，上述結(jié)果進(jìn)一步證明circACTN4可能與FUBP1競爭性結(jié)合，阻斷FIR對MYC的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而促進(jìn)BC的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。

CircACTN4促進(jìn)體內(nèi)異種移植腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

為了評估circACTN4在體內(nèi)的致癌作用，通過皮下注射和尾靜脈注射在裸鼠中建立人BC細(xì)胞腫瘤模型。用過表達(dá) circACTN4 慢病毒或 circACTN4 shRNA 慢病毒及其對照感染的 MCF-7 細(xì)胞接種雌性裸鼠。結(jié)果表明，circACTN4過表達(dá)組異種移植腫瘤的體積和重量明顯大于對照組，而circACTN4敲低顯著抑制了腫瘤生長。與對照組相比，circACTN4的上調(diào)明顯增加了轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的數(shù)量，而circACTN4沉默顯著抑制了自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，侵襲性腫瘤細(xì)胞較少。此外，circACTN4 的過表達(dá)可以顯著促進(jìn)腫瘤血管生成，而 circACTN4 敲低顯著降低腫瘤微血管密度。WB結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)或沉默circACTN4組的異種移植腫瘤組織中MYC的蛋白質(zhì)水平分別顯著增加或減少。生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，在circACTN4過表達(dá)組中檢測到更強(qiáng)和更多的生物發(fā)光信號，而circACTN4沉默組中的小鼠與對照組相比顯示出更少的生物發(fā)光轉(zhuǎn)移數(shù)量。與對照組相比，circACTN4 過表達(dá)組的小鼠總體存活率較低，肝轉(zhuǎn)移范圍更廣。最后，我們通過 IHC 確定了 circACTN4 對其靶蛋白 MYC、下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 CDK4 和 CCND2 以及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白 Ki67 的影響。結(jié)果表明，circACTN4的上調(diào)可以增加腫瘤組織中MYC、CDK4、CCND2和Ki67的表達(dá)，而circACTN4的沉默降低了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。綜上所述，上述結(jié)果進(jìn)一步證明了circACTN4在乳腺癌中的致癌作用，提示circACTN4可以通過激活原癌基因MYC促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。