RAS GTPase RIT1通過(guò)抑制紡錘體組裝檢查點(diǎn)降低有絲分裂的保真度
2021年6月，最新一篇發(fā)表在Curr Biol（IF=9.601）的文章（The RAS GTPase RIT1 compromises mitotic fidelity through spindle assembly checkpoint suppression.）從共生功能體視點(diǎn)的角度對(duì)29名接受同種異體造血干細(xì)胞移植的兒童的腸道、口腔和鼻腔微生物群進(jìn)行了綜合宿主微生物群分析。首次揭示了RIT1直接與SAC核心組件MAD2和p31conmet相互作用；CDK1在有絲分裂過(guò)程中磷酸化RIT1并抑制其與SAC的相互作用；RIT1是細(xì)胞有絲分裂及時(shí)進(jìn)展所必需的；RIT1致病水平促進(jìn)染色體分離錯(cuò)誤。
背景：RIT1突變已被確定為肺腺癌的致癌因素和努南綜合征的病因因素。RIT1有一組獨(dú)特的效應(yīng)蛋白，但與其他Ras GTPases共享MAPK通路的激活。然而，由于缺乏確定的同源GTPase激活蛋白或交換因子，RIT1 GTPase周期的調(diào)控仍不清楚。盡管如此，RIT1的豐度和活性是通過(guò)蛋白酶體降解在蛋白水平上調(diào)控的，這種機(jī)制是由適配器蛋白LZTR1和E3泛素連接酶Cullin 3 (CRL3LZTR1)介導(dǎo)的。RIT1在Noonan綜合征中的作用很可能是通過(guò)MAPK通路的過(guò)度激活介導(dǎo)的，MAPK通路是該疾病的一種癥狀體征，但它在正常細(xì)胞和惡性腫瘤中的作用尚不清楚.
紡錘體裝配檢查點(diǎn)(SAC)作為一個(gè)傳感器的獨(dú)立的著絲點(diǎn)延遲有絲分裂進(jìn)入后期，直到適當(dāng)?shù)娜旧w分離得到保證。這一安全機(jī)制的破壞導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和非整倍體，這是胚胎死亡、先天性出生缺陷、智力殘疾和癌癥的遺傳原因。然而，盡管了解了控制SAC的基本機(jī)制，但信號(hào)通路如何直接與有絲分裂檢查點(diǎn)活動(dòng)相互作用和調(diào)節(jié)仍是未知的。在對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、生存和分化的多種信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)被激活，這一過(guò)程顯著受到Ras家族小鳥(niǎo)苷三磷酸酶(GTPases)的調(diào)控。RIT1是一種ras相關(guān)的GTPase，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和應(yīng)激反應(yīng)，是通過(guò)有絲分裂和適當(dāng)?shù)娜旧w分離及時(shí)進(jìn)展的必要條件。RIT1在有絲分裂期間從質(zhì)膜(PM)分離，并直接與SAC蛋白MAD2和p31conmet相互作用，該過(guò)程受周期蛋白依賴性激酶1 (CDK1)活性的調(diào)節(jié)。此外，致病水平的RIT1沉默了SAC，并通過(guò)將MAD2從有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合體(MCC)中分離出來(lái)，加速了通過(guò)有絲分裂的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，致病性RIT1抑制SAC促進(jìn)染色體分離錯(cuò)誤和非整倍體。我們的研究結(jié)果突出了RIT1與其他Ras GTPases相比的獨(dú)特功能，并闡明了信號(hào)通路與SAC之間通過(guò)一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制的直接聯(lián)系。
一、RIT1直接與SAC蛋白MAD2和p31conmet相互作用
為了表征RIT1相互作用組，我們進(jìn)行了親和純化-質(zhì)譜篩選(圖1A)，確定MAD2 (MAD2L1)和p31conmet(也稱(chēng)為MAD2L1結(jié)合蛋白)作為新的和選擇性的RIT1結(jié)合伙伴，不與其他Ras GTPases相互作用(圖S1A和S1B)。
MAD2參與了在未附著的動(dòng)點(diǎn)處催化MCC形成的SAC信號(hào)放大，MCC由MAD2、CDC20、BubR1和Bub3.1組成。16 MAD2和p31conmet二聚促使我們?cè)u(píng)估RIT1是否與MAD2和p31conmet直接相互作用。Pull down分析顯示，這兩種相互作用都直接且獨(dú)立于MAD2和p31conmet二聚(圖1B)。此外，RIT1-MAD2相互作用在斑馬魚(yú)和果蠅中是保守的(圖1C)。為了確定RIT1與MAD2或p31conmet的結(jié)合是否受其GTPase周期的調(diào)控，我們?cè)u(píng)估了與GTPgS(一種不可水解的GTP類(lèi)似物)加載的RIT1的結(jié)合。這表明這兩種相互作用都不依賴于RIT1的鳥(niǎo)苷核苷酸負(fù)載狀態(tài)(圖1D)。一致地，與MAD2和p31conmet的結(jié)合不受與疾病相關(guān)的RIT1突變的影響(圖S1C)。這些結(jié)果表明，結(jié)合界面位于對(duì)GDP/GTP結(jié)合敏感的RIT1 s開(kāi)關(guān)I和II結(jié)構(gòu)域外，因此MAD2和p31conmet不是典型的RIT1效應(yīng)蛋白。MAD2和p31conmet的結(jié)構(gòu)相似性突出了RIT1的潛在結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。因此，我們使用了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，其中滴定MAD2野生型(WT)或R133E/Q134A (RQ)，一個(gè)二聚體和p31結(jié)合缺陷的突變體，未能抑制rit1 -p31conmet結(jié)合(圖1E)。由于RIT1 g結(jié)構(gòu)域與其他Ras - GTPases，特別是它的鄰域RIT2之間的相似性，假設(shè)RIT1 s的n端或c端延伸可能介導(dǎo)與MAD2和p31conmet的相互作用(圖1F)。隨后分析了RIT1 N-或c -末端缺失突變體，證明了c -末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span>MAD2和p31conmet星結(jié)合是必要和充分的(圖1G、1H和S1J)。
二、RIT1與MAD2和p31conmet的相互作用由CDK1磷酸化調(diào)控
在間期，RIT1 s c端尾部介導(dǎo)質(zhì)膜(PM)結(jié)合然而，在分析有絲分裂細(xì)胞時(shí)，我們觀察到RIT1在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂和進(jìn)入中期并在后期快速易位到PM時(shí)的彌漫性胞質(zhì)分布(圖2A和2B)。同樣，在有絲分裂細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到內(nèi)源性RIT1的主要胞質(zhì)分布(圖2C)。(S209D/E)磷酸化，而非(S209A)缺磷，突變破壞了RIT1-MAD2/p31conmet結(jié)合(圖2D)。RIT1磷酸化在有絲分裂過(guò)程中最為豐富(圖2E)。抑制CDK1顯著降低了重組RIT1的磷酸化(圖2F)。免疫印跡檢測(cè)和質(zhì)譜證實(shí)CDK1/CyclinB1磷酸化RIT1 S209，(圖2G和2H)。
三、RIT1及時(shí)調(diào)節(jié)后期進(jìn)入和染色體分離保真度
MAD2和p31conmet調(diào)節(jié)SAC的持續(xù)時(shí)間，反過(guò)來(lái)，也調(diào)節(jié)有絲分裂的持續(xù)時(shí)間。這促使我們研究RIT1是否通過(guò)與MAD2和p31conmet的直接關(guān)聯(lián)來(lái)影響SAC。通過(guò)RNAi或crispr介導(dǎo)的敲除去除RIT1可延長(zhǎng)有絲分裂進(jìn)程(圖3A和S3A S3E)。此外，SAC的藥理抑制挽救了RIT1耗盡的作用，表明RIT1以SAC依賴的方式影響有絲分裂。此外，RIT1的缺失增加了染色體分離錯(cuò)誤的發(fā)生率(圖3B)，這表明RIT1不僅對(duì)有絲分裂的及時(shí)進(jìn)展至關(guān)重要，而且RIT1蛋白水平的失調(diào)也破壞了正常的SAC功能。LZTR1或RIT1M90I表達(dá)的缺失加速了異步生長(zhǎng)細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，這一效應(yīng)依賴于PM釋放RIT1(圖3C、S3H和S3I)。同樣，RIT1 WT或M90I的過(guò)表達(dá)部分覆蓋了藥物誘導(dǎo)的SAC反應(yīng)(圖3D和S3J)。RIT1M90I的異位表達(dá)以依賴MAD2-和p31come結(jié)合的方式顯著增加了有絲分裂錯(cuò)誤的發(fā)生率，包括滯后染色體和橋接染色體(圖3G和S3O)。因此，我們觀察到在表達(dá)RIT1M90I的細(xì)胞中非整倍體率增加，但在表達(dá)不能結(jié)合MAD2/p31conmet的突變體的細(xì)胞中卻沒(méi)有(圖3H和S3P)。這些結(jié)果表明，RIT1水平的增加會(huì)導(dǎo)致與MAD2和p31conmet的直接相互作用，從而降低有絲分裂的保真度。
四、RIT1抑制MCC-MAD2結(jié)合，促進(jìn)APC/C底物降解
在MAD1與未連接的動(dòng)點(diǎn)結(jié)合后，MAD2從開(kāi)放的構(gòu)象狀態(tài)(O-MAD2)轉(zhuǎn)化為封閉的構(gòu)象狀態(tài)(C-MAD2)， SAC信號(hào)被緊密調(diào)控和放大。MAD2的構(gòu)象變化啟動(dòng)了它與CDC20的結(jié)合。為了直接測(cè)試RIT1是否抑制了MAD2與CDC20或MAD1的關(guān)聯(lián)，進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)性pull-down實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試RIT1-MAD2和MAD2-CDC20/ MAD1結(jié)合之間的互斥性(圖4A和4B)。MAD2結(jié)合肽1 (MBP1)是一種模擬CDC20和MAD1相互作用基序(MIM)的高親和合成肽，它取消了MAD2- rit1的結(jié)合。評(píng)估了RIT1與O-或c -狀態(tài)穩(wěn)定的MAD2突變體的結(jié)合(圖4C)。用過(guò)量的RIT1 c端尾肽孵育MAD2蛋白，并用凝膠過(guò)濾分離(圖4D)。RIT1M90I顯著降低了MAD2- CDC20和BubR1-CDC20的相互作用(圖4E和4F)；表明致病RIT1蛋白水平阻礙MCC的完整性，符合RIT1從CDC20中隔離MAD2并促進(jìn)MCC拆卸的模型。
用重組RIT1補(bǔ)充這些提取物增加了CyclinB1和Securin的泛素化和降解，表明APC/C活性增加，可能是由于MCC抑制緩解(圖4G)。RIT1缺失細(xì)胞顯示CyclinB1降解延遲(圖4H)。此外，RIT1M90I的表達(dá)加速了正常細(xì)胞生長(zhǎng)下CyclinB1的降解(圖4I);然而，其對(duì)CyclinB1降解的影響在藥理學(xué)誘導(dǎo)的有絲分裂阻滯下被消除(圖S4M)，這表明致病性水平的RIT1不能抑制過(guò)度活躍的SAC反應(yīng)。