lncRNA在NPM1突變的急性髓系白血病事件中的罪證

核磷蛋白(Nucleophosmin，NPM1)是急性髓系白血病(AML)中最常見(jiàn)的突變基因，會(huì)導(dǎo)致編碼的核仁蛋白(NPM1c⁺)發(fā)生異常胞漿易位。NPM1c ⁺維持一個(gè)獨(dú)特的白血病基因表達(dá)程序，以激活HOXA/B簇和MEIS1癌基因?yàn)樘卣?，促進(jìn)白血病發(fā)生。然而，NPM1c⁺控制這種基因表達(dá)模式促進(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制仍在很大程度上未知。本文揭示了HOXBLINC lncRNA激活在NPM1c ⁺白血病中扮演促癌作用。HOXBLINC和其合作者MLL1是NPM1c⁺ AML的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2021年3月發(fā)表在《Nature Communications》IF:14.919。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調(diào)

HOX基因，特別是HOXA和HOXB聚類(lèi)基因的上調(diào)不僅是AML發(fā)病的特點(diǎn)，也是其主要機(jī)制。HoxBlinc lncRNA已經(jīng)被證明是在發(fā)育過(guò)程中激活前HoxB基因轉(zhuǎn)錄所必需的。為了確定HOXBLINC是否與HOXB基因一起在AML中異常表達(dá)，檢測(cè)了正常BMMNC細(xì)胞和CD34+陽(yáng)性細(xì)胞，以及NPM1c ⁺AML病人中HOXBLINC lncRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺AML病人中顯著高表達(dá)，在TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)一樣的結(jié)果（圖1A-B）。表明HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調(diào)。

2、HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生

隨后鑒定了NPM1c ⁺AML和NPM1c ^WTAML病人中的差異表達(dá)基因，與WT相比，有871個(gè)下調(diào)基因和980個(gè)上調(diào)基因，包括HoxBlinc和NPM1c+的特征基因HoxB2-5，HoxA7,9-11，Meis1，Runx1（圖1c）。然后，通過(guò)RNA-seq分析比較了對(duì)照組和HOXBLINCi細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄組變化。一致地，NPM1c+細(xì)胞表現(xiàn)出HOXBLINC lncRNA和常見(jiàn)的NPM1c+ AML標(biāo)記基因的高表達(dá)(圖1d)。有趣的是，在OCI-AML3細(xì)胞中抑制HOXBLINC顯著抑制了許多NPM1c+標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄，如HOXB2-5、HOXA9-11、RUNX1和MEIS1(圖1d)。GSEA和GO分析顯示，HOXBLINC的缺失會(huì)影響NPM1突變、HOXA9通路、癌癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞命運(yùn)、髓樣細(xì)胞分化以及Wnt和JAK-STAT信號(hào)通路中涉及AML的通路和基因（圖1e-f）。此外，與對(duì)照組相比，HOXBLINC KD顯著抑制OCI-AML3細(xì)胞增殖（圖1g）。當(dāng)把Dox誘導(dǎo)的HOXBLINC KD OCI-AML3克隆移植到NOD-scid IL2Rγnull (NSG)小鼠，然后進(jìn)行Dox誘導(dǎo)或?qū)φ仗幚頃r(shí)，與未接受Dox處理的小鼠相比，Dox處理的受體小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)（圖1h）。并且HOXBLINC KD顯著增加了小鼠預(yù)后，以及腫瘤病理改變（圖1i-j）。因此，HOXBLINCKD降低了腫瘤負(fù)擔(dān)，并減弱了體內(nèi)白血病進(jìn)展，這可能是NPM1c+ AML患者的特異性。

圖1 HOXBLINC在NPM1c+ AML患者中被激活，HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生

3、HoxBlinc在造血中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致小鼠的AML樣致死疾病

已有研究表明，小鼠造血干細(xì)胞(HSCs)中人源化NPM1c+敲入等位基因(NPM1c/+)的激活會(huì)導(dǎo)致Hox基因過(guò)度表達(dá)、增強(qiáng)self-real和骨髓增生擴(kuò)大，以及遲發(fā)性AML的發(fā)展。由于NPM1c+激活HOXBLINC，而HOXBLINC對(duì)NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生至關(guān)重要，因此確定HOXBLINC的激活是否足以導(dǎo)致異常造血和類(lèi)似于NPM1c/+小鼠的髓系惡性腫瘤非常重要。HoxBlinc在長(zhǎng)期(LT)和短期(ST)造血干細(xì)胞中表達(dá)高，在祖細(xì)胞(MPP, CMP和GMP)中表達(dá)降低，除了B220+ B細(xì)胞，在成熟細(xì)胞系中進(jìn)一步降低（圖2a）。HoxBlinc在造血中的表達(dá)模式提示該lncRNA可能在調(diào)控HSPC功能中發(fā)揮重要作用。為了研究HoxBlinc活化對(duì)體內(nèi)正常造血和白血病發(fā)生的影響，構(gòu)建了HoxBlinc轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型，在Vav1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(HS321/45-vav載體)的控制下，將全長(zhǎng)小鼠HoxBlinc cDNA插入小鼠基因組，以確保轉(zhuǎn)基因在造血系統(tǒng)中的特異性表達(dá)(圖2b)。獲得2只HoxBlincTg小鼠。將該轉(zhuǎn)基因插入到Tg第1系18q染色體上Bin1基因的內(nèi)含子中(圖2c)。BM細(xì)胞中HoxBlinc RNA的表達(dá)水平分別是Tg Line #1和#2內(nèi)源性HoxBlinc表達(dá)水平的18倍和3倍(圖2d)。

對(duì)HoxBlincTg (Line #1)小鼠隊(duì)列的監(jiān)測(cè)顯示，1歲以?xún)?nèi)，67%的HoxBlincTg小鼠(15只中有10只)因病死或被殺，而WT小鼠(n = 12只)沒(méi)有死亡（圖2e）。與野生型相比，垂死的HoxBlincTg小鼠表現(xiàn)出體重減輕、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大以及腳墊和股骨蒼白（圖2f）。形態(tài)學(xué)上，May-Grünwald-Giemsa染色顯示母細(xì)胞明顯增加(圖2g，左)。BM細(xì)胞自旋制備也顯示髓系細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，未成熟髓系前體增多(圖2g，右側(cè))。骨髓組織切片的形態(tài)學(xué)評(píng)估顯示髓樣增生伴未成熟髓樣前體增多，以髓過(guò)氧化物酶(MPO)陽(yáng)性表明髓樣來(lái)源（圖2h）。此外，HoxBlincTg的組織學(xué)評(píng)估顯示脾臟、肝臟和淋巴結(jié)切片正常器官結(jié)構(gòu)扭曲，并有MPO陽(yáng)性骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2h-i）。這些數(shù)據(jù)表明，與NPM1c/+小鼠相似，HoxBlinc過(guò)表達(dá)小鼠足以引起類(lèi)似AML的異常血液學(xué)特征。

圖2 HoxBlinc轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)小鼠導(dǎo)致致死性AML

4、HoxBlinc基因表達(dá)增強(qiáng)HSC自我更新，擴(kuò)大骨髓形成

NPM1c+促進(jìn)HSC自我更新和髓細(xì)胞擴(kuò)張的能力已被明確。為了進(jìn)一步了解HoxBlinc在AML發(fā)病機(jī)制中的作用，研究了HoxBlinc過(guò)表達(dá)對(duì)HSPC功能的影響。HoxBlincTg BM細(xì)胞中Lin^- scale-1⁺c-Kit⁺ (LSK)細(xì)胞的比例明顯高于野生型小鼠，而Lin^- scale-1^- c-Kit⁺ (LK)細(xì)胞群與野生型小鼠相似（圖3a）。計(jì)算ST-HSCs LT-HSCs總數(shù)時(shí)，股骨和多能祖細(xì)胞(MMP)計(jì)算基于比例LSK內(nèi)細(xì)胞群和BM多孔性，LT-和ST-HSCs池，但不是MPP明顯擴(kuò)大，盡管只有ST-HSCs LSK內(nèi)細(xì)胞的比例增加（圖3b）。當(dāng)對(duì)LK細(xì)胞內(nèi)的每個(gè)髓系祖細(xì)胞群進(jìn)行分析時(shí)，HoxBlincTg小鼠中GMP的百分比顯著高于WT小鼠，但MEP/CMP細(xì)胞群的百分比低于WT小鼠（圖3c）。因此，HoxBlinc過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HSPC池失調(diào)，導(dǎo)致體內(nèi)造血系統(tǒng)向髓系傾斜。

接下來(lái)，通過(guò)體外復(fù)制、配對(duì)子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)移植研究了HoxBlinc過(guò)表達(dá)對(duì)造血干細(xì)胞自我更新和再生能力的影響。在HoxBlincTg LSK細(xì)胞中，連續(xù)4輪的復(fù)制電位均顯著高于WT細(xì)胞(圖3d)。使用WT和HoxBlincTg原始CD34?LSK細(xì)胞的配對(duì)子細(xì)胞檢測(cè)顯示，具有對(duì)稱(chēng)自我更新能力的HoxBlincTg CD34?LSK細(xì)胞比例更高，而進(jìn)行對(duì)稱(chēng)分化或不對(duì)稱(chēng)自我更新的細(xì)胞比WT減少（圖3e）。競(jìng)爭(zhēng)移植實(shí)驗(yàn)表明，HoxBlincTg BM細(xì)胞移植后，受體外周血中供體細(xì)胞(CD45.2+)嵌合率穩(wěn)定上升，移植7個(gè)月后達(dá)到~80%，而WT BM細(xì)胞移植后小鼠外周血中CD45.2+細(xì)胞群保持在~50%（圖3f）。有趣的是，接受HoxBlincTg BM細(xì)胞的小鼠在移植后2.5-7個(gè)月死亡率更高(圖3g)?？傮w而言，HoxBlinc基因在小鼠中的表達(dá)增強(qiáng)了HSC的自我更新，并擴(kuò)大了骨髓形成，導(dǎo)致AML樣疾病，與NPM1c/+小鼠中看到的表型相似。

圖3 HoxBlinc轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強(qiáng)HSC自我更新，擴(kuò)大骨髓形成

5、HoxBlinc的過(guò)表達(dá)通過(guò)提高HSPC⁺中增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性激活NPM1c+標(biāo)記基因

為了進(jìn)一步確定HOXBLINC是否是NPM1c+的下游介質(zhì)，以維持HSPC中NPM1c+標(biāo)記基因的激活，對(duì)8周齡小鼠的WT和HoxBlincTg LSK細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq，總計(jì)鑒定到1281個(gè)差異表達(dá)基因（圖4a）。其中，上調(diào)的有718個(gè)，下調(diào)的有563個(gè)。值得注意的是，在NPM1c/⁺ vs . WT LSK細(xì)胞中，27.3%的上調(diào)基因和21%的下調(diào)基因基因重疊（圖4b）。GSEA分析HoxBlincTgv s. WT LSK細(xì)胞差異表達(dá)基因揭示了與NPM1c / +與WT LSK細(xì)胞相似的轉(zhuǎn)錄特征和富集通路，包括NPM1-mutated特征，HOXA9致癌途徑，HSC增殖，細(xì)胞命運(yùn)的承諾，骨髓分化，Wnt和JAK-STAT信號(hào)通路（圖4c-d）。

由于HoxBlinc通過(guò)招募SETD1A和MLL1復(fù)合物，并在HoxB前位點(diǎn)組織活躍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)HoxB前基因的表達(dá)，NPM1c+或HoxBlincTg引起的HoxBlinc上調(diào)可以通過(guò)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性來(lái)激活其在HSPC中的靶基因。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，使用WT、NPM1c/+和HoxBlincTg小鼠的LSK細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析高通量測(cè)序 (ATAC-seq)。巧合的是，NPM1c/+和HoxBlincTg LSK細(xì)胞有相當(dāng)一部分基因表現(xiàn)出啟動(dòng)子可及性的增加(28.9%)或減少(24.3%)（圖4e）。此外，NPM1c+或HoxBlincTg使啟動(dòng)子可及性增加的基因中有相當(dāng)一部分也上調(diào)，這些基因包括NPM1c特征基因HoxB2-5、HoxA9-10、Meis1和Runx1，以及其他靶基因如Stat1和Cdr2（圖4f-g）。這些結(jié)果表明HoxBlinc lncRNA的過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)HSPC中增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性特異性激活NPM1c+標(biāo)記基因。

圖4 HoxBlinc過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)LSK細(xì)胞啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性激活NPM1c+標(biāo)記基因

6、HoxBlinc直接與靶基因結(jié)合，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

CTCF邊界促進(jìn)了受限拓?fù)湎嚓P(guān)域(TADs)內(nèi)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的相互作用。作者之前報(bào)道了后HOXA位點(diǎn)的CTCF邊界建立和維持活躍的TAD，以驅(qū)動(dòng)后HOXA基因表達(dá)。為了研究HoxBlinc過(guò)表達(dá)是否會(huì)影響CTCF定義的HoxB位點(diǎn)前TAD域和增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用高通量測(cè)序捕捉環(huán)狀染色體構(gòu)象(4C-seq) 使用HoxB位點(diǎn)CTCF結(jié)合位點(diǎn)(cbs)作為HoxBlincTg與WT Lin?c-Kit+細(xì)胞（圖5a）。有趣的是，HoxBlinc過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了這些由CBS5 /5和/或+43CBS介導(dǎo)的HoxB前位點(diǎn)內(nèi)的長(zhǎng)程相互作用（圖5b）。而+73Kb CBS (+73CBS)和HoxB13 CBS (CBS13)與前HoxB基因不互作，盡管+73CBS與CBS5/6和CBS8/9存在交互作用，但不受HoxBlinc過(guò)表達(dá)的影響（圖5b）。此外，HoxBlinc過(guò)表達(dá)也誘導(dǎo)了CBS4/5和/或+43CBS與HoxBlinc靶基因如Stat1、Crd2和后HoxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的長(zhǎng)程相互作用，而非HoxBlinc靶基因HoxD（圖5c）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc與CBS4/5和+43CBS協(xié)調(diào)，促進(jìn)并維持與NPM1c+標(biāo)記基因位點(diǎn)的長(zhǎng)期染色質(zhì)相互作用，從而激活它們。

為了完全理解HoxBlinc過(guò)表達(dá)調(diào)控HSPC造血轉(zhuǎn)錄程序的機(jī)制，進(jìn)行了ChIRP-seq在WT和HoxBlincTg Lin ^- c-Kit⁺細(xì)胞中繪制基因組HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)。HoxBlinc的過(guò)表達(dá)顯著增加了其與HoxB前基因啟動(dòng)子區(qū)域和其他反式靶點(diǎn)的結(jié)合，如Stat1、Cdr2、Wnt5a、Runx1和后HoxA基因（圖5d）。Lin^-c-Kit+細(xì)胞基因組中HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)的整體分布表明，HoxBlinc主要與非編碼區(qū)相互作用，包括基因間區(qū)、內(nèi)含子和啟動(dòng)子。值得強(qiáng)調(diào)的是，HoxBlinc的過(guò)表達(dá)顯著增加了其與啟動(dòng)子和UTR的占用（圖5e）。整合來(lái)自WT和HoxBlincTg HSPC的ChIRP-seq、RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)集顯示，大約74%的基因HoxBlinc結(jié)合增加表現(xiàn)在基因表達(dá)水平增加兩倍以上（圖5f），44.7%的基因表現(xiàn)出啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性增強(qiáng)（圖5g）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc直接結(jié)合造血特異性靶基因，主要是NPM1c+特征基因，并介導(dǎo)染色質(zhì)的長(zhǎng)程相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖5 HoxBlinc直接與靶基因結(jié)合，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

7、MLL1的募集對(duì)于HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的靶基因表達(dá)和HSPC功能異常至關(guān)重要

由于HoxBlinc招募SETD1A和MLL1復(fù)合物在小鼠ECS衍生的原始紅細(xì)胞祖細(xì)胞的HoxB位點(diǎn)組織活性染色質(zhì)域。所以作者先證實(shí)了人類(lèi)HOXBLINC與MLL1和SETD1A的相互作用。然后體內(nèi)外研究SETD1A和MLL1在HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的HSPC功能異常和白血病發(fā)生中是否重要。然而，在HoxBlincTg LSK細(xì)胞中，敲除Mll1而非Setd1a能夠緩解HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的異常復(fù)制潛能（圖6a）。當(dāng)使用表達(dá)慢病毒對(duì)照或shMll1的HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞進(jìn)行移植時(shí)，與表達(dá)HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞的shScramble相比，mll1KD顯著延長(zhǎng)了接受shMll1表達(dá)HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞的受體的存活時(shí)間(圖6b)。而mll1KD也能很大程度上恢復(fù)HoxBlincTg小鼠中CD117+/CD11b+未成熟髓系細(xì)胞和GMPs的異常擴(kuò)增以及貧血(圖6c, d)。這些數(shù)據(jù)表明Mll1 KD能夠緩解HoxBlinc過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的AML發(fā)展。

由于MLL1在HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的異常造血過(guò)程中至關(guān)重要，HSPC中HoxBlinc過(guò)表達(dá)可能通過(guò)增加MLL1募集來(lái)激活其靶基因，從而提高H3K4me3占用率，以促進(jìn)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性。為了證實(shí)這一點(diǎn)，使用WT和HoxBlincTg LSK細(xì)胞進(jìn)行了MLL1和H3K4me3 ChIP-seq。ChIP-seq和CHIRP-seq聯(lián)合分析顯示HoxBlinc和MLL1的基因組結(jié)合位點(diǎn)存在高度重疊（圖6e-g）。令人驚訝的是，51.2%的基因HoxBlinc結(jié)合增加顯示MLL1招募增加，其中大部分(31.7%)也顯示H3K4me3占用增加，包括NPM1c+-標(biāo)記基因，如前HoxB、后HoxA、Meis1和Runx1，以及其他造血基因，如Stat1和Cdr2（圖6e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc過(guò)表達(dá)通過(guò)增加MLL1的募集和隨后H3K4me3占用的增強(qiáng)來(lái)介導(dǎo)靶基因的表達(dá)。

圖6 MLL1的募集對(duì)于HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的靶基因表達(dá)和HSPC功能異常至關(guān)重要

總之，本文發(fā)現(xiàn)HOXBLINC過(guò)表達(dá)是驅(qū)動(dòng)白血病發(fā)生的關(guān)鍵事件，通過(guò)控制MLL1招募、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和啟動(dòng)子的順式和反式表達(dá)，建立異常NPM1c+標(biāo)記基因表達(dá)程序。因此，本研究不僅為HSC和NPM1突變的AML的生物學(xué)提供了分子視角，而且還為NPM1c+ AML的藥物靶點(diǎn)識(shí)別創(chuàng)造了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。

參考文獻(xiàn)：

Zhu Ganqian., Luo Huacheng., Feng Yang., Guryanova Olga A., Xu Jianfeng., Chen Shi., Lai Qian., Sharma Arati., Xu Bing., Zhao Zhigang., Feng Ru., Ni Hongyu., Claxton David., Guo Ying., Mesa Ruben A., Qiu Yi., Yang Feng-Chun., Li Wei., Nimer Stephen D., Huang Suming., Xu Mingjiang.(2021). HOXBLINC long non-coding RNA activation promotes leukemogenesis in NPM1-mutant acute myeloid leukemia. Nat Commun, 12(1), 1956. doi:10.1038/s41467-021-22095-2