m6A閱讀器YTHDC2通過抑制SLC7A11依賴性抗氧化功能抑制肺腺癌腫瘤發(fā)生

肺腺癌 (LUAD) 是最常見的非小細(xì)胞肺癌類型。然而，LUAD 腫瘤發(fā)生的潛在機制在很大程度上是未知的。N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各種人類癌癥中的關(guān)鍵作用，包括肺癌。今天來講一篇關(guān)于m6A與肺癌的文章，題名為：The m 6 A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function（IF=11.79）。

YTHDC2的抑制與LUAD中的腫瘤進(jìn)展有關(guān)

為了評估m6A閱讀器在肺癌中的表達(dá)譜，通過 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析了已知的閱讀器，包括 YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1 和 IGF2BP1/2。其中，與正常肺相比，LUAD 和 LUSC 中只有 YTHDC2 下調(diào)。然而，IGF2BP2 在 LUAD 和 LUSC 中差異表達(dá)。Oncomine 數(shù)據(jù)庫還顯示 YTHDC2 在 LUAD 中通常被下調(diào)。Kaplan-Meier 圖的分析進(jìn)一步表明，較低的 YTHDC2 與 LUAD 中較差的總體生存率相關(guān)。這些結(jié)果使我們研究了 YTHDC2 在 LUAD 中的作用。

患者肺癌組織樣本中，與鄰近的正常組織相比，在腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA 和蛋白質(zhì)的顯著下調(diào)。類似地，與 BEAS-2B 細(xì)胞相比，已建立的 LUAD 細(xì)胞系中的 YTHDC2 減少。組織芯片分析表明 YTHDC2 在 51% (98/192) 的 LUAD 患者中下調(diào)。值得注意的是，YTHDC2 的下調(diào)與更大的腫瘤直徑和更晚期的階段有關(guān)。表明 YTHDC2 抑制促進(jìn)了 LUAD 中的腫瘤進(jìn)展。

YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域表現(xiàn)出抗腫瘤活性

為了在體內(nèi)探索YTHDC2的 m 6 A 閱讀器功能，在有或沒有 m 6 A 識別 YTH 結(jié)構(gòu)域的情況下實現(xiàn)了 YTHDC2 的肺過表達(dá)，并生成了基于 KP 和 GFP 標(biāo)記的 KPY WT、KPY ΔYTH和對照 KPE 小鼠。除了強烈的 GFP 信號外，與感染后 25 周的 KPE 小鼠相比，YTHDC2 被證實在來自 KPY WT和 KPY ΔYTH小鼠的腫瘤中持續(xù)上調(diào)。，表明 AAV5 表達(dá)系統(tǒng)的持久效率。盡管YTHDC2無法阻止肺腫瘤發(fā)生，但腫瘤發(fā)生時間被延遲，壓倒性的肺腫瘤負(fù)荷被顯著抑制，KPY WT小鼠的存活時間比KPE小鼠和KPY ΔYTH小鼠長。

我們進(jìn)一步研究了 YTHDC2 是否是人類 LUAD 細(xì)胞中的腫瘤抑制因子。選擇 H1975 和 H1299 細(xì)胞是因為它們分別在測試的 LUAD 細(xì)胞系中表現(xiàn)出最高和最低的 YTHDC2 表達(dá)。IB 檢測證實了 YTHDC2 的過表達(dá)和敲除效率。雖然在 H1299 細(xì)胞中YTHDC2 WT過表達(dá)后3D 球體的數(shù)量和大小以及異種移植物的腫瘤生長減少，但在 YTHDC2 ΔYTH過表達(dá)后未觀察到這些影響。相比之下，敲除 H1975 細(xì)胞中的 YTHDC2 會增加小鼠的球體形成和異種移植物生長。值得注意的是，當(dāng)使用 YTHDC2 sg2-抗性（res）重建 YTHDC2 表達(dá)時，YTHDC2-sg2 在腫瘤發(fā)生中的積極作用得以恢復(fù)。因此，YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域在 LUAD 中發(fā)揮腫瘤抑制功能。這些結(jié)果也解釋了為什么 Ythdc2 在鼠腫瘤中的顯著表達(dá)和 H1299 細(xì)胞中的 YTHDC2當(dāng)突變體過表達(dá)時，沒有改變轉(zhuǎn)化表型。

YTHDC2 抑制胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

通常在具有高致瘤特性的腫瘤中觀察到代謝活性。為了研究 YTHDC2 對代謝物的影響，進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，比較了具有低和高 YTHDC2 表達(dá)（的LUAD 標(biāo)本。GSH 代謝是確定的前 20 條 KEGG 途徑之一。在顯著改變的代謝物中，與 YTHDC2高腫瘤相比，在 YTHDC2低腫瘤中觀察到胱氨酸增加了 3.975 倍。此外，觀察到 YTHDC2 與細(xì)胞內(nèi)胱氨酸之間呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明 YTHDC2 減少細(xì)胞內(nèi)胱氨酸。

為了驗證 YTHDC2 是否降低了胱氨酸攝取，我們培養(yǎng)了具有高 (pHY#1-8) 或低 (pLY#1-8) YTHDC2 表達(dá)水平的原代患者來源的 LUAD 細(xì)胞。L- 14 C-胱氨酸攝取測定結(jié)果表明，YTHDC2 通過其 YTH 結(jié)構(gòu)域抑制了 H1299 和 H1975 細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植物、小鼠形成的 LUAD 和患者來源的 LUAD 細(xì)胞中的胱氨酸攝取。已顯示CHAC1 mRNA 水平的上調(diào)表明胱氨酸攝取受損。事實上，觀察到 YTHDC2 增加了CHAC1 mRNA 水平。胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng) Xc -通過谷氨酸的反向轉(zhuǎn)運導(dǎo)入胱氨酸。谷氨酸釋放測定結(jié)果顯示 YTHDC2 抑制谷氨酸釋放。這些結(jié)果表明 YTHDC2 通過抑制系統(tǒng) Xc - 來損害胱氨酸攝取。System Xc -對氧化還原平衡和新陳代謝至關(guān)重要，以及YTHDC2 的 YTH 結(jié)構(gòu)域?qū)?/span> H1299 和 H1975 細(xì)胞中GSH/GSSG 和 NAD + /NADH 比率的改變，進(jìn)一步表明 YTHDC2 可能損害系統(tǒng) Xc -功能。

受損的系統(tǒng) Xc -功能與 GSH 水平降低有關(guān)。來自患者來源的 LUAD 細(xì)胞和小鼠腫瘤的數(shù)據(jù)表明 YTHDC2 確實降低了 GSH。為了研究下游的胱氨酸抗氧化劑是否補償了 YTHDC2 的抗腫瘤作用，給小鼠注射了 GSH 和 NAC，一種半胱氨酸前體。給予 NAC 和 GSH 的KPY WT小鼠肺中的腫瘤負(fù)荷顯著高于載體治療的對照小鼠，并且水平與 KPE 小鼠相似。有趣的是，與KPE 小鼠相比，GSH 和 NAC 給藥僅導(dǎo)致 KPY WT小鼠腫瘤中 GSH/GSSG 比率的顯著增加。該結(jié)果的一個潛在原因是 YTHDC2 損害系統(tǒng) Xc -，我們提出系統(tǒng) Xc -功能的損害可能對促進(jìn) GSH 及其除胱氨酸以外的原料，如半胱氨酸或其前體進(jìn)入細(xì)胞。

正如之前的研究中所報道的，缺乏 GSH 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加。因此，熒光探針（C11-BODIPY 581/591）用于測量小鼠 LUAD 中的氧化脂質(zhì)。此外，作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的 4-HNE 和 MDA 水平在 KPY WT的腫瘤中增加，但在 KPY ΔYTH 中沒有增加小鼠與 KPE 小鼠相比。值得注意的是，在 KPY WT小鼠中，NAC 和 GSH 補充劑可減少脂質(zhì)過氧化并縮短存活時間?？傮w而言，這些結(jié)果表明YTHDC2的 m 6 A 讀取功能對于減少胱氨酸下游抗氧化程序至關(guān)重要

YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達(dá)

雖然抑制系統(tǒng) Xc -功能與 YTHDC2 受損的胱氨酸攝取有關(guān)，YTHDC2 如何調(diào)節(jié)系統(tǒng) Xc -仍不清楚。SLC7A11，催化亞基，在維持系統(tǒng) Xc -活性方面發(fā)揮著重要作用。使用 UALCAN 數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)與正常肺相比，LUAD 中的 SLC7A11 上調(diào)。此外，較高的 SLC7A11 導(dǎo)致 LUAD 患者的總生存期較短。值得注意的是，YTHDC2 與 LUAD 中的 SLC7A11 呈負(fù)相關(guān)。因此，SLC7A11 可能與 YTHDC2 的功能相反，以維持胱氨酸攝取。

接下來，研究了 YTHDC2 是否調(diào)節(jié) SLC7A11。在 H1299 和 H1975 細(xì)胞中，SLC7A11 的蛋白質(zhì)和 mRNA 水平都受到 YTHDC2 的負(fù)調(diào)控。在小鼠中，與來自 KPE 和 KPY ΔYTH小鼠的腫瘤相比，來自 KPY WT小鼠的腫瘤中的 Slc7a11 下調(diào)。此外，YTH 結(jié)構(gòu)域是 YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達(dá)的先決條件。

隨后，我們研究了 YTHDC2 是否通過 SLC7A11 抑制胱氨酸攝取。當(dāng) YTHDC2 在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時，異位表達(dá) SLC7A11 完全恢復(fù)了受損的胱氨酸攝取。相反，YTHDC2 缺失誘導(dǎo)的胱氨酸攝取被靶向 H1975 細(xì)胞中 SLC7A11 的 shRNA 逆轉(zhuǎn)。ATF4 和 NRF2 是SLC7A11轉(zhuǎn)錄的兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。與 ATF4 不同，NRF2 無法上調(diào) H1299 細(xì)胞中的 SLC7A11，這可能是由于 LUAD 單元格上下文特定的影響。值得注意的是，過表達(dá) YTHDC2 仍然拮抗 ATF4 的作用。因此，YTHDC2 損害依賴于 SLC7A11 的胱氨酸攝取。

還研究了換著樣本中 YTHDC2 和 SLC7A11 的臨床相關(guān)性。與鄰近組織相比，YTHDC2 在腫瘤中被下調(diào)，而 SLC7A11 在腫瘤中被上調(diào)。此外，它們在腫瘤中呈負(fù)相關(guān)。

YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減

進(jìn)一步研究了通過 YTHDC2 調(diào)節(jié) SLC7A11 表達(dá)的機制。因為 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平都受到 YTHDC2 的負(fù)調(diào)控，我們想確定 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平是否都被 YTHDC2 抑制。為了解決這個問題，首先研究了 YTHDC2 是否調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA。當(dāng) YTHDC2 在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時，YTH 結(jié)構(gòu)域在抑制SLC7A11啟動子活性方面沒有作用。敲除 YTHDC2 然后在 H1975 細(xì)胞中重建其表達(dá)也表明 YTHDC2 調(diào)節(jié)SLC7A11轉(zhuǎn)錄。然后，我們用泛轉(zhuǎn)錄抑制劑 ActD 處理 H1299 和 H1975 細(xì)胞，以檢查 YTHDC2 是否在轉(zhuǎn)錄被阻斷后調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn) YTH 結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span> YTHDC2 縮短SLC7A1 1 mRNA的半衰期是必不可少的H1299 細(xì)胞。通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)喪失 YTHDC2 功能，隨后在 H1975 細(xì)胞中重建 YTHDC2 進(jìn)一步證實 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減。。刪除 EXOSC10 而不是 XRN2，減弱了 YTHDC2 對縮短SLC7A1 1 mRNA 半衰期的影響。，表明 YTHDC2 促進(jìn) 3'-5' SLC7A1 1 mRNA 降解。在藥理學(xué)水平上，用 DEPC 和 RNasin 這兩種泛 RNase 抑制劑處理 H1299 細(xì)胞也阻斷了 YTHDC2 的功能。這些發(fā)現(xiàn)確立了 YTHDC2 在破壞LUAD 細(xì)胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性中的作用。

YTHDC2 調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA 穩(wěn)定性，控制 RNA 衰變是 m 6 A 甲基化的重要功能之一。。YTHDC2抑制SLC7A11的功能是否依賴于m 6 A甲基化仍然未知。在三個主要作者中，即 METTL3、METTL14 和 WTAP，與 H1299 細(xì)胞相比，僅發(fā)現(xiàn)較高的 METTL3 表達(dá)水平與 H1975 細(xì)胞中較高的整體 m 6 A 甲基化水平相關(guān)。METTL3增加H1299和H1975細(xì)胞中m 6A。在 H1975 細(xì)胞中敲低 METTL3 延長了SLC7A1 1 mRNA的半衰期，而在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) METTL3 加速了SLC7A1 1 mRNA 降解。此外，H1299 細(xì)胞中降低的 METTL3 表達(dá)會阻止 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰變，損害胱氨酸攝取并刺激脂質(zhì)活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生。表明 YTHDC2 在 LUAD 細(xì)胞中的作用是 m 6 A 依賴性的。

SLC7A1 1 mRNA 被 m 6 A 甲基化

為了揭示SLC7A1 1 mRNA 中潛在的 m 6 A 甲基化位點，在H1975細(xì)胞中 METTL3 敲低之前和之后進(jìn)行了 MeRIP-seq。GGAC 基序在 H1975 細(xì)胞的m6A 位點高度富集，無論是否敲除METTL3。m6A 峰在靠近 mRNA 終止密碼子的 3' 非翻譯區(qū) (3'UTR) 中尤為豐富。MeRIP-seq 揭示了一個推定的m6A 基序位于 3'UTR。該位點周圍的 m 6 A 富集與 m 6 A 甲基化水平相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)SLC7A1 1 mRNA的 m6A 依賴性修飾，進(jìn)行了 MeRIP-qPCR。在H1975細(xì)胞中敲除 METTL3 后，SLC7A1 1 mRNA 中的m 6 A 修飾在推定的 m 6 A 位點周圍顯著減少。相反，當(dāng) METTL3 在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時，觀察到相反的結(jié)果。因此，我們提供了證據(jù)表明SLC7A1 1 mRNA 可以在 LUAD 細(xì)胞中被 m 6 A 甲基化。

盡管 YTHDC2 用作 m6A 閱讀器，但YTHDC2是否優(yōu)先結(jié)合并識別 m 6 A 甲基化的SLC7A1 1 mRNA 尚不清楚。首先進(jìn)行了評估SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。結(jié)果表明，通過在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) METTL3來增加 m 6 A 甲基化水平促進(jìn)了 YTHDC2 與SLC7A1 1 mRNA 的結(jié)合。相比之下，一旦 METTL3 在 H1975 細(xì)胞中被敲除，SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用就被顯著抑制。無論 METTL3 是過度表達(dá)還是被敲低，YTH 結(jié)構(gòu)域的缺失都會阻止SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。接下來，我們使用合成的部分SLC7A11 3'UTR 探針進(jìn)行了體外 RNA 下拉測定，并將它們與來自表達(dá) HA 標(biāo)記的 YTHDC2 WT和 YTHDC2 ΔYTH 的H1299 細(xì)胞的裂解物一起孵育。YTHDC2 WT，但不是 YTHDC2 ΔYTH，與含有未甲基化腺苷的SLC7A1 1 mRNA的 3'UTR相比，更優(yōu)先結(jié)合含有 m 6 A 的mRNA。此外，YTHDC2 易于結(jié)合 m 6 A 共有基序 GGAC，這與位于推定的 m 6 A 位點內(nèi)的相同，因為當(dāng) GGAC 被取代時，觀察到SLC7A11 3'UTR-YTHDC2 相互作用顯著減少一個隨機的 CCAG 主題。最后，進(jìn)行了 RIP-qPCR 測定以評估 m6 A 甲基化是否調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。實際上，與 H1299 細(xì)胞相比，更高的整體 m 6 A 甲基化在H1975細(xì)胞中引起了更強的SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。從 METTL3 在 H1299 和 H1975 細(xì)胞中的功能獲得和喪失實驗中，我們還得出結(jié)論，細(xì)胞內(nèi)SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用是由 m 6 A 水平?jīng)Q定的。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先結(jié)合m 6 A-甲基化的SLC7A1 1 mRNA。

然后，我們檢查了YTHDC2 是否通過假定的m6A 位點使SLC7A1 1 mRNA不穩(wěn)定。我們克隆野生型（WT）SLC7A11 3'UTR和突變型（MUT）3'UTR的螢火蟲熒光素酶的下游pmirGLO 質(zhì)粒中的編碼區(qū)。結(jié)果表明，僅過表達(dá) YTHDC2 WT而不是過表達(dá)YTHDC2 ΔYTH 會降低H1299 細(xì)胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性，而敲除 YTHDC2 可增加其在 H1975 細(xì)胞中的穩(wěn)定性。然而，與 WT 3'UTR 相比，Mut 報告基因的這些影響減弱了。在檢查pmirGLO 質(zhì)粒表達(dá)的外源F-Luc-SLC7A11融合 mRNA的 RNA 穩(wěn)定性后，獲得了類似的結(jié)果。。總體而言，3'UTR的 m 6 A 位點對于 YTHDC2 破壞SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

具有 YTHDC2 抑制的 LUAD 對系統(tǒng) X C -靶向治療敏感

為了評估 YTHDC2 抑制在 LUAD 中的重要性，患者樣本中隨機選擇了20 個 YTHDC2低LUAD，其中 50% 屬于腺泡亞型。。要了解YTHDC2的患病率較低的腺泡亞型，另一種群組＃2被吸收特定于腺泡亞型。在隊列#2（n = 100）中，與鄰近組織相比，腫瘤中的 YTHDC2 下調(diào)，并且 62%（62/100）的腺泡組織被歸類為 YTHDC2低與沒有這種表達(dá)模式的患者相比，YTHDC2低的腺泡 LUAD 患者的總生存期要短得多。進(jìn)一步證明 YTHDC2 抑制可能對腺泡 LUAD 的腫瘤進(jìn)展特別重要。

YTHDC2抑制SLC7A11; 因此，我們推測 SLC7A11 在腺泡 LUAD 中同時上調(diào)。事實上，這在隊列#2 中是正確的。最近，使用系統(tǒng) X C -抑制劑。我們想知道哌嗪埃拉汀 (PKE) 是一種穩(wěn)定的埃拉汀體內(nèi)衍生物，是否對腺泡 LUAD 具有潛在的治療作用。此外，同時對索拉非尼進(jìn)行了檢查。PDX 小鼠模型對于評估患者的治療敏感性很有價值。因此，來自 4 名不同腺泡 LUAD 患者的 PDX 模型被給予 PKE 和索拉非尼。由于小鼠傳代，未觀察到 YTHDC2 和 SLC7A11 的組織病理學(xué)和表達(dá)的顯著變化。與 DMSO 處理的對照相比，當(dāng)給予 PKE 和索拉非尼時，觀察到顯著的腫瘤消退。此外，給小鼠服用PKE和索拉非尼也會導(dǎo)致腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加。表明誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可能是抑制腺泡 LUADs 腫瘤發(fā)生的結(jié)果。

最后，我們招募了另外兩個隊列來驗證我們的結(jié)論。雖然第 3 組 LUAD 患者是從華北招募的，第 4 組也從中國上海招募，但時間范圍與第 1 組不同。與隊列#1 的觀察結(jié)果相似，MDA 和 YTHDC2 受到抑制，而與隊列 #3 中的鄰近組織相比，腫瘤中 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平均升高（n = 30），證實了 LUAD 中 YTHDC2 的抑制通過上調(diào) SLC7A11 來防止脂質(zhì)過氧化。在隊列#4（n = 20/每個階段）中，MDA 和 YTHDC2 呈負(fù)相關(guān)，而 SLC7A11 與階段正相關(guān)，表明 SLC7A11 升高可能是抑制 YTHDC2 以促進(jìn) LUAD 進(jìn)展的關(guān)鍵