與癌癥外泌體結(jié)合的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子決定細(xì)胞因子受體表達(dá)細(xì)胞的攝取和生物分布

轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞擴(kuò)散到遠(yuǎn)端部位的過(guò)程，約占癌癥死亡率的90%。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)移起始腫瘤細(xì)胞顯示了基本的內(nèi)在特征，如細(xì)胞可塑性、遷移和侵襲能力增強(qiáng)、抗凋亡和免疫編輯。此外，原發(fā)性腫瘤可以釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其他蛋白質(zhì)因子，這些因子能夠?yàn)檠h(huán)癌細(xì)胞的到來(lái)啟動(dòng)遠(yuǎn)處組織，從而創(chuàng)造一個(gè)能夠支持轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。癌細(xì)胞分泌囊泡，特別是外泌體，是已知的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的基本介質(zhì)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體顯著促進(jìn)細(xì)胞間通訊和隨后的腫瘤微環(huán)境重新編程。

今天我們講一篇關(guān)于腫瘤外泌體分布吸收重塑免疫微環(huán)境的文章，該文章題名為Tumor microenvironmental cytokines bound to cancer exosomes determine uptake by cytokine receptor-expressing cells and biodistribution（IF=14.9），發(fā)表在Nature Communications期刊。

腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子影響器官特異性外泌體積累并促進(jìn)轉(zhuǎn)移

通過(guò)分析從健康受試者和乳腺癌（BC）患者的血漿中分離出的外顯體，確定了許多與外泌體共同分離的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，在BC患者來(lái)源的外泌體上發(fā)現(xiàn)了更豐富和多樣性。特別是，當(dāng)通過(guò) ELISA 評(píng)估時(shí)，證實(shí)在來(lái)自 BC 患者的外泌體樣品中更高水平的CCL2和IL-6表達(dá)。形成鮮明對(duì)比的是，從體外培養(yǎng)的 EO771 BC 細(xì)胞中分離出的純外泌體在很大程度上缺乏細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。為了評(píng)估外泌體在細(xì)胞因子環(huán)境中的行為，從同基因、原位 EO771 癌腫塊中獲得了外泌體耗盡的腫瘤間質(zhì)液 (TIF)，其顯示了一系列細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，包括CCL2和IL-6。將EO771細(xì)胞衍生的外泌體添加到這種外泌體耗盡的TIF中，隨后重新分離外泌體以去除游離的未結(jié)合的可溶性因子，顯示出特定外泌體/細(xì)胞因子關(guān)聯(lián)的富集。例如，CCL2、IL-6 和 CXCL1 很容易共同分離，而 GM-CSF 則無(wú)法檢測(cè)到。評(píng)估小鼠中與TIF衍生細(xì)胞因子綴合的EO771外泌體的行為，我們發(fā)現(xiàn) TIF 綴合的外泌體以顯著高于對(duì)照外泌體的豐度保留在各個(gè)器官中并導(dǎo)致白細(xì)胞攝取增加。幾種免疫細(xì)胞譜系，包括 NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞和粒細(xì)胞髓源性抑制細(xì)胞 (mMDSCs; gMDSCs )在肝臟、脾臟和肺中，與未結(jié)合的外泌體相比，TIF 外泌體的外泌體攝取量更高。

有趣的是，重復(fù)注射 TIF-外泌體改變了肺的免疫細(xì)胞組成有趣的是，重復(fù)注射 TIF-外泌體改變了肺的免疫細(xì)胞組成、脾和肝臟。這些改變包括：雙肺 NK 細(xì)胞減少和脾臟；肺中 gMDSCs 的增加; 肝臟中樹突狀細(xì)胞（DC）的頻率降低；和的Ly6C的更高的頻率-巨噬細(xì)胞，將其報(bào)道與免疫應(yīng)答相關(guān)的和肝。

轉(zhuǎn)移前生態(tài)位被認(rèn)為是循環(huán)癌細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的允許環(huán)境，因此通過(guò)重復(fù)注射先前與 TIF 孵育的外泌體，然后注射同基因癌細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成。?與未結(jié)合的外泌體相比，用 TIF 結(jié)合的外泌體對(duì)小鼠進(jìn)行調(diào)理后顯著（p < 0.05）增加了肺中的轉(zhuǎn)移形成?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子能夠與癌癥衍生的外泌體相關(guān)聯(lián)，從而引起遠(yuǎn)端器官免疫景觀的變化，并隨后增加轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。

細(xì)胞因子通過(guò)蛋白聚糖的 GAG 側(cè)鏈與癌癥衍生的外泌體的外表面結(jié)合

為了評(píng)估細(xì)胞因子與癌癥衍生的外泌體關(guān)聯(lián)背后的機(jī)制，評(píng)估了細(xì)胞因子是位于外泌體內(nèi)還是與外泌體外膜結(jié)合。為了研究它們的亞外泌體定位，我們添加了重組人或小鼠 CCL2 和 IL-6，這兩種細(xì)胞因子都存在于血漿外泌體分離物和TIF中，用于兩種人和兩種鼠癌細(xì)胞系衍生的外泌體。孵育后，通過(guò)重新純化外泌體去除未結(jié)合的細(xì)胞因子。我們確實(shí)觀察到兩種 CCL2 的濃度依賴性增加和 IL-6在這些環(huán)境中的外泌體分離物中。值得注意的是，CCL2 與鼠 PyMT 細(xì)胞衍生的外泌體的結(jié)合相對(duì)低于所有其他設(shè)置。進(jìn)一步用蛋白酶 K 處理 CCL2 結(jié)合的 BC 外泌體，其濃度可導(dǎo)致外膜蛋白（如 CD9）降解，但不會(huì)降解囊泡內(nèi) HSP70，確認(rèn)破壞僅限于外泌體表面。用蛋白酶 K 處理 BC 外泌體的表面表示大部分 CCL2 位于外泌體外膜上。此外，在裂解的囊泡和完整的囊泡之間未觀察到 CCL2 含量的顯著差異，表明在這種情況下，囊內(nèi)細(xì)胞因子對(duì)總外泌體 CCL2 水平的貢獻(xiàn)很小。我們通過(guò)CCL2溫育后的外泌體的表面分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS），其檢測(cè)從膜蛋白上的外來(lái)體分子指紋。與沒(méi)有添加細(xì)胞因子的外泌體相比，與 CCL2 預(yù)偶聯(lián)的 BC 外泌體在幾個(gè)波段顯示出不同的光譜強(qiáng)度。然后應(yīng)用主成分分析 (PCA) 來(lái)識(shí)別 CCL2 偶聯(lián)外泌體的主要光譜模式。與 CCL2 結(jié)合的外泌體與非結(jié)合的外泌體可以清楚地區(qū)分，它們的光譜主要繪制在主成分 1 (PC1) 的正側(cè)。SERS 僅在非?？拷F金屬基底的地方檢測(cè)拉曼光譜，表明大多數(shù)可檢測(cè)的 CCL2 信號(hào)來(lái)自囊泡表面。此外，通過(guò)將 PC1 加載數(shù)據(jù)與單獨(dú)重組 CCL2 的特征拉曼信號(hào)進(jìn)行比較，我們觀察到 PC1 中有助于 CCL2-外泌體分布的正峰表現(xiàn)出與 CCL2 信號(hào)相似的模式，尤其是在 1004 和 1362 cm -1 附近。這些觀察結(jié)果表明外泌體樣品之間的差異確實(shí)是由來(lái)自 CCL2 的 SERS 信號(hào)引起的。

對(duì)于我們檢測(cè)到的與血漿外泌體相關(guān)的大多數(shù)細(xì)胞因子，BC 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)評(píng)估并未識(shí)別出同源受體。然而，分析我們的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)了大量的硫酸乙酰肝素 (HS) 和硫酸軟骨素 (CS) 蛋白聚糖，包括 CD44、HSPG2、glypican-1（GPC -1）、多聚糖（VCAN）和 syndecan-1（SDC1），在 BC 外泌體中。有趣的是，兩種鼠 BC 細(xì)胞來(lái)源的 EO771 和 PyMT 外泌體的蛋白多糖譜非常不同。定量地，ELISA 分析顯示 MDA-MB-231 細(xì)胞衍生的外泌體表現(xiàn)出與 EO771 相似的蛋白聚糖譜。GAG的存在于蛋白聚糖已顯示出結(jié)合細(xì)胞因子在不同細(xì)胞背景。因此，我們?cè)u(píng)估了這種結(jié)合在外泌體環(huán)境中是否也可能存在，并表明 versican、syndecan-1 和 CD44，以及 HSPG2，與外泌體結(jié)合的 CCL2 共沉淀。此外，添加分別催化蛋白聚糖的 HS 和 CS 鏈降解的肝素酶 III (HepIII) 和軟骨素酶 ABC (ChABC) 裂解酶，減少了 CCL2 與外泌體的結(jié)合?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞外細(xì)胞因子可以通過(guò)蛋白聚糖的外泌體表面 GAG 側(cè)鏈與癌細(xì)胞分泌的外泌體結(jié)合。

細(xì)胞因子結(jié)合改變外泌體的生物分布和細(xì)胞譜系特異性攝取

為了確定上述觀察到的 TIF 偶聯(lián)外泌體分布改變的機(jī)制，將 CCL2 偶聯(lián)、熒光標(biāo)記的 EO771 BC 細(xì)胞衍生的外泌體靜脈注射到同基因小鼠中。各種器官（包括肝、脾、腎、肺、心臟和骨髓）的離體成像證明 CCL2 偶聯(lián)的外泌體在肺中的積累顯著增加，這通過(guò)肺組織切片的熒光顯微鏡證實(shí)。CCL2 優(yōu)先與其受體 CCR2 結(jié)合，肺白細(xì)胞通常為 CCR2 +。相反，據(jù)報(bào)道也作為 CCL2 受體發(fā)揮作用的 CCR4，在肺白細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到。與未結(jié)合的外泌體相比，CCL2 結(jié)合的外泌體被肺 CD45.2 + CCR2 +白細(xì)胞更有效地吸收，而 CD45.2 + CCR2 -白細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出不同的吸收。特別是在顯示不同 CCR2 +和 CCR2 -群體的mMDSC 中，我們發(fā)現(xiàn)與 CCR2 -細(xì)胞相比，CCL2 +細(xì)胞中CCL2 偶聯(lián)的外泌體更豐富，而未偶聯(lián)的外泌體攝取相似。還觀察到CCR2 + NK 細(xì)胞特異性攝取 CCL2 綴合的外泌體增加的趨勢(shì)，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 WT 小鼠中改變的生物和細(xì)胞譜系分布相反, CCL2 結(jié)合的 BC 外泌體對(duì)器官分布沒(méi)有影響，肺積聚或肺 CD45.2 +細(xì)胞攝取在 CCR2 -/-小鼠中。最后，與未結(jié)合的外泌體相比，用 CCL2 結(jié)合的外泌體調(diào)理 WT 小鼠，然后注射同系癌細(xì)胞，導(dǎo)致?肺轉(zhuǎn)移形成顯著增加（p < 0.05），而對(duì) BC 轉(zhuǎn)移沒(méi)有影響。 CCR2 -/-小鼠的肺。有趣的是，與僅注射 PBS 的對(duì)照組相比，單獨(dú)重復(fù)注射重組 CCL2 不影響 BC 轉(zhuǎn)移。更有趣的是，先前與 TIF 孵育的外泌體不影響 CCR2 -/-小鼠肺中 BC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)，表明外泌體結(jié)合的 CCL2 在 BC 轉(zhuǎn)移性傳播中的關(guān)鍵作用。

   總之，這些數(shù)據(jù)表明 CCL2 與 BC 外泌體的結(jié)合改變了它們的全身生物分布以及細(xì)胞譜系特異性的囊泡攝取，并且可能有助于由 TIF 偶聯(lián)的 BC 外泌體在遠(yuǎn)端器官中誘導(dǎo)的促轉(zhuǎn)移變化，從而促進(jìn)BC轉(zhuǎn)移。