間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體microRNA-139-5p通過(guò)靶向PRC1抑制膀胱癌的發(fā)生

膀胱癌是世界上第九大流行癌癥，占癌癥相關(guān)死亡的相當(dāng)大比例。目前多數(shù)研究熱點(diǎn)在microRNAs (miRNAs)可以通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來(lái)源的外泌體傳遞到腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮其功能?，F(xiàn)在有最新研究探討了miR-139-5p向膀胱癌細(xì)胞的外泌體轉(zhuǎn)移及其在腫瘤發(fā)生調(diào)控中的作用，支持了MSCs-衍生的外泌體分泌的miR-139-5p在膀胱癌中的腫瘤抑制作用，突出了一個(gè)有前景的治療策略。該研究發(fā)表于《Oncogene》，IF：9.867。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1. PRC1在膀胱癌中的表達(dá)模式及意義

作者對(duì)5個(gè)膀胱癌數(shù)據(jù)集（GSE7476、GSE52519、GSE65635、GSE40355和GSE3167）進(jìn)行差異表達(dá)分析，通過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)PRC1是一個(gè)高表達(dá)基因，與其他基因廣泛相關(guān)（圖1a-c）。此外，GSE7476、GSE65635、GSE40355和GSE3167數(shù)據(jù)集中顯示了PRC1在膀胱癌中高表達(dá)(圖1d-g)。接下來(lái)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)、免疫組織化學(xué)和western blot分析，確定膀胱癌及癌旁正常組織中PRC1 mRNA和蛋白的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，膀胱癌組織中PRC1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，PRC1陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高 (圖1h-j)。采用卡方檢驗(yàn)分析PRC1表達(dá)與臨床資料的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PRC1表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，而與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤數(shù)量(表1)。此外，與正常膀胱上皮細(xì)胞HCV29相比，膀胱癌細(xì)胞株(T24、J82、UMUC3、5637)中PRC1 mRNA和蛋白表達(dá)量較高，其中T24細(xì)胞表達(dá)量最高(圖1k， l)。因此，選擇T24細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 PRC1在膀胱癌中表達(dá)異常

2. PRC1功能缺失可改善體外膀胱癌細(xì)胞的致瘤特性

通過(guò)sh-PRC1評(píng)估PRC1在膀胱癌進(jìn)展中的生物學(xué)意義(圖2a)。Edu(圖2b)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP-生物素nick末端標(biāo)記(TUNEL)(圖2c)和Transwell(圖2d-f)檢測(cè)表明，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均減弱，而轉(zhuǎn)染sh1-PRC1后細(xì)胞凋亡率增加。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)因子、b細(xì)胞白血病/淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)因子(N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、SNAIL)、增殖相關(guān)因子、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)模式。如預(yù)期，沉默PRC1后，N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA的表達(dá)減少，echerin和Bax的表達(dá)增加(圖2g)。綜上所述，這些結(jié)果表明PRC1的沉默抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲潛能，同時(shí)促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的凋亡。

圖2 沉默PRC1抑制膀胱癌細(xì)胞增殖潛能，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡

3. miR-139-5p結(jié)合到PRC1的3’UTR

在發(fā)現(xiàn)PRC1在膀胱癌中的作用后，繼續(xù)檢索了mirDIP、miRmap、starBase、TargetScan和microRNA.org等5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)調(diào)控PRC1的miRNAs，進(jìn)一步研究膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制。如圖3a所示，hsa-miR-224-5p和hsa-miR-139-5p這兩個(gè)相互重疊的miRNA被確定為潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，通過(guò)分析GSE40355數(shù)據(jù)集篩選膀胱癌中差異表達(dá)的miRNA。miR-139-5p在膀胱癌中低表達(dá)(圖3b)；PRC1-3’UTR中發(fā)現(xiàn)了潛在的miR-139-5p特異性結(jié)合位點(diǎn)(圖3c)；隨后，進(jìn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RT-qPCR和Pearson相關(guān)性分析，均證明了miR-139-5p能結(jié)合PRC1-3’UTR上的位點(diǎn)，它們表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (圖3d-f)。另外，與癌旁組織相比，miR-139-5p在膀胱癌組織中表達(dá)較低，在膀胱癌細(xì)胞株T24，J82， UMUC3和5637持續(xù)降最低在T24細(xì)胞(圖3 g)。同時(shí)后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明，miR-139-5p是PRC1的負(fù)調(diào)控因子(圖3h， i)。

圖3 miR-139-5p靶向并負(fù)調(diào)控PRC1

4. miR-139-5p的上調(diào)可通過(guò)靶向PRC1改善膀胱癌細(xì)胞的致瘤特性

為了研究miR-139-5p在膀胱癌發(fā)展中的功能意義及其靶向PRC1的潛在功能，在T24細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或抑制miR-139-5p的表達(dá)。通過(guò)EdU(圖4a)、TUNEL(圖4b)、Transwell(圖4c， d)和western blot(圖4e)檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)表明，過(guò)表達(dá)miR-139-5p可顯著降低T24細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡率。同時(shí)N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2、PCNA蛋白表達(dá)減少，E-cadherin、Bax蛋白表達(dá)增加。

圖4 miR-139-5p對(duì)膀胱癌進(jìn)展的抑制作用是通過(guò)負(fù)向調(diào)控PRC1實(shí)現(xiàn)的

5. 分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)中的外泌體

在光學(xué)顯微鏡下觀察到hUCMSCs呈細(xì)長(zhǎng)或紡錘形，菌落生長(zhǎng)，呈旋渦狀排列。同時(shí)，hUCMSCs表現(xiàn)出強(qiáng)大的成骨、成脂和成軟骨分化能力(圖5a)，表明hUCMSCs已成功從人臍帶中分離。外泌體隨后從成功分離的hUCMSCs中提取。透射電鏡下觀察到一組圓形或橢圓形、形態(tài)均勻的膜性囊泡，囊泡直徑為52.5-185.5 nm，囊泡周?chē)梢?jiàn)膜性結(jié)構(gòu)，囊泡中央呈低電子密度(圖5b，c)。Western blot檢測(cè)表明，hUCMSCs的外泌體中表面標(biāo)記物熱休克蛋白70 (HSP70)、CD63和CD9的表達(dá)高于hUCMSCs，而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94 (GRP94)的表達(dá)低于hUCMSCs (p <0.05;圖5d)，進(jìn)一步說(shuō)明外泌體已成功提取。

圖5 hUCMSCs來(lái)源的外泌體鑒定

6. hUCMSCs來(lái)源的外泌體miR-139-5p在體外改善膀胱癌細(xì)胞的致瘤特性

為了驗(yàn)證T24細(xì)胞是否能夠攝取hUCMSCs分泌的外泌體，將CFSE標(biāo)記的hUCMSCs來(lái)源的外泌體與T24細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，隨后在共聚焦顯微鏡下觀察T24細(xì)胞攝取外泌體(圖6a)，結(jié)果顯示，hUCMSCs來(lái)源的外泌體能夠?qū)?/span>miR-139-5p傳遞到T24細(xì)胞(圖6b-d)。為了確定外泌體傳遞miR-139-5p的影響，將T24細(xì)胞與過(guò)表達(dá)miR-139-5p的hUCMSCs衍生的外泌體共培養(yǎng)。EdU(圖6e)， TUNEL(圖6f)Transwell(圖6g，h)結(jié)果表明，細(xì)胞增殖，遷移和入侵的能力都被抑制， 而與外泌體的缺失相比， Exo-NCmimic、Exo-miR-139-5p-mimic和Exo-NC-inhibitor轉(zhuǎn)染后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與miR-139-5p mimic轉(zhuǎn)染的hUCMSCs衍生的外泌體共培養(yǎng)的T24細(xì)胞中，N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA蛋白表達(dá)減少，E-cadherin和Bax蛋白表達(dá)增加(圖6i)。綜上所述，miR-139-5p的傳遞抑制了T24細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，同時(shí)通過(guò)hUCMSCs衍生的外泌體加速T24細(xì)胞的凋亡。

圖6 hUCMSCs來(lái)源的外泌體miR-139-5p抑制膀胱癌細(xì)胞增殖潛能并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

7. hUCMSCs來(lái)源的外泌體miR-139-5p抑制體內(nèi)膀胱腫瘤的發(fā)生

最后，為了證明miR- 139-5p在hUCMSCs來(lái)源的外泌體體內(nèi)的抑瘤作用，將裸鼠皮下注射T24細(xì)胞，建立皮下移植瘤模型，且驗(yàn)證了miR-139-5p成功遞送至腫瘤組織(圖7a)。如圖7b-d所示，hUCMSCs來(lái)源的外泌體降低了移植瘤的體積和重量，在注射過(guò)表達(dá)miR-139-5p的hUCMSCs來(lái)源的外泌體的裸鼠中，腫瘤體積和重量的降低更為明顯。采集裸鼠腫瘤組織，評(píng)估腫瘤組織中PRC1的表達(dá)模式，從hUCMSCs中提取的外泌體可以降低PRC1在腫瘤組織中的表達(dá)，而從hUCMSCs中提取的外泌體可以顯著降低miR-139-5p在腫瘤組織中的表達(dá)(圖7e)。同時(shí)，通過(guò)western blot檢測(cè)腫瘤組織中凋亡、EMT和增殖相關(guān)因子的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，Exo-NC-agomir或ExomiR- 139-5p agomir的存在導(dǎo)致N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA的表達(dá)降低，而E-cadherin和Bax的表達(dá)升高，然而，在對(duì)Exo-miR-139-5p agomir的反應(yīng)中觀察到更為顯著的結(jié)果(圖7f)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，從hUCMSCs來(lái)源的外泌體中miR- 139-5p成功轉(zhuǎn)移到T24細(xì)胞中，抑制其在裸鼠中的異種移植生長(zhǎng)。

圖7 從hUCMSCs來(lái)源的外泌體遞送miR-139-5p抑制裸鼠膀胱癌細(xì)胞的致瘤性

總結(jié)：

該研究為miR-139-5p的抗腫瘤作用提供了新的思路，并進(jìn)一步為基于外泌體的miR-139-5p傳遞系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞中的治療策略提供了案例。結(jié)果表明，外泌體遞送miR-139-5p有助于抑制腫瘤發(fā)生(圖8)，為潛在的抑制腫瘤發(fā)生的創(chuàng)新方案奠定了基礎(chǔ)。

圖8 miR-139-5p在膀胱癌中的作用及其分子機(jī)制示意圖

參考文獻(xiàn)：

Jia Y, Ding X, Zhou L, Zhang L, Yang X. Mesenchymal stem cells-derived exosomal microRNA-139-5p restrains tumorigenesis in bladder cancer by targeting PRC1. Oncogene. 2021, 40(2):246-261. doi: 10.1038/s41388-020-01486-7. Epub 2020 Oct 29. PMID: 33122828.