circINPP4B調節(jié)自身免疫性腦脊髓炎的Th17細胞分化
CircRNAs調節(jié)基因表達，參與多種生物學和病理過程。然而，關于特定circRNA對T輔助細胞17 (Th17)分化和相關自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化癥(MS)的影響知之甚少。本文使用轉錄組微陣列分析實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的不同階段，確定了與EAE進展相關的circINPP4B，該circINPP4B在EAE小鼠Th17細胞和Th17體外分化過程中表達上調。該文于2021年8月發(fā)表于《Cellular Molecular Immunology》IF:11.53雜志上。
技術路線：
主要實驗結果：
1、通過芯片分析鑒定與EAE相關的circRNA
作者構建了EAE小鼠模型，通過EAE的臨床特征得分分為4組，如圖1A所示，EAE的染色表現為脊髓炎癥浸潤和脫髓鞘加重。取不同鑒定分數(0、1、2、3、4)的EAE小鼠外周血CD4+淋巴細胞進行芯片檢測，獲得差異表達的circRNA，其中circRNA-3998在EAE得分高的組中高表達，提示可能與EAE進展有關。
圖1 通過微陣列分析鑒定EAE相關的circRNA
2、在CD4+T細胞中circINPP4B的特征
如圖2所示，circRNA-3998定位于8號染色體，包含6個外顯子，來源于INPP4B基因，長684bp，其反向剪切位點位于外顯子8和外顯子3之間，并通過隨機引物和oligo (dT)18引物證實其環(huán)狀特性。將其命名為circINPP4B。
圖2 在CD4+T細胞中circINPP4B的特征
3、CircINPP4B與Th17細胞體外分化有關
為了探究circINPP4B的表達水平和在EAE進展中的特異性，作者檢測了來源于0-4分EAE小鼠的CD4+T細胞中的表達，結果顯示隨著EAE的加重，circINPP4B在CD4+T細胞中的表達逐漸升高（圖3A）。并且與在CD4+ Tn細胞中相比，circINPP4B在CD4+ IL-17+ T細胞中表達升高明顯，在CD4+IFN-γ+ T細胞和CD4+CXCR5+ T細胞中表達稍微增長（圖3B）。于是進一步探究circINPP4B在CD4+ IL-17+ T細胞中的作用。作者在體外誘導CD4+ Tn細胞分化為Th17細胞，并發(fā)現circINPP4B的表達隨著誘導天數逐漸增加（圖3C）。FISH實驗結果表明circINPP4B在Rorγt+Th17細胞中顯著高表達（圖3D）。之后作者發(fā)現，敲除circINPP4B后，導致分化為Th17細胞的比例顯著下降同時也降低了Th17細胞相關細胞因子的分泌水平（圖3E-I）。以上結果表明circINPP4B與Th17細胞體外分化有關。
圖3 CircINPP4B與Th17細胞體外分化有關
4、沉默circINPP4B可緩解體內EAE
基于以上circINPP4B高表達與EAE進展有關的事實，構建CD4+淋巴細胞circINPP4B敲除的小鼠模型。MOG35-55免疫后，circINPP4B沉默小鼠出現EAE緩解，發(fā)病延遲，EAE峰值評分降低（圖4A-B）。HE和LFB染色表明circINPP4B沉默小鼠的脊髓切片的炎癥浸潤和脫髓鞘更低，此外其MBP蛋白水平增加，并具有更多有髓鞘的軸突和更厚的髓鞘（圖4C）。此外，與對照鼠相比，circINPP4B沉默小鼠的外周血，脊髓和淋巴結中IL-17+淋巴細胞組分更低，Th17相關細胞因子水平更少（圖4D-F）。
為了進一步證實circINPP4B在體內誘導Th17細胞分化的作用，將circINPP4B沉默的CD4+ Tn細胞轉至年齡匹配的Rag1?/?免疫缺陷小鼠中，然后進行EAE誘導。盡管實驗小鼠和對照小鼠的CD4+細胞數量無差別，但是接受circINPP4B沉默的CD4+ Tn細胞轉移的Rag1?/?小鼠的EAE得分更低，且IL-17+淋巴細胞組分更低，而IFN-γ+淋巴細胞沒有差異。這些表明沉默circINPP4B可能抑制Th17細胞分化，進而緩解EAE。
圖4 沉默circINPP4B可緩解體內EAE
5、CircINPP4B作為miR-30a的海綿
為了鑒定與circINPP4B相互作用的miRNA，對不同得分EAE小鼠來源的外周血CD4+淋巴細胞進行miRNA微陣列分析，獲得差異表達的miRNA，根據circINPP4B的表達趨勢，作者關注于在EAE得分增加的小鼠中下調表達的9個miRNA，并構建了網絡圖哦，其中circINPP4B與miR-30a的相互作用強烈（圖5A-C）。此外，在Th17細胞分化過程中，circINPP4B的表達逐漸增加，而miR-30a的表達逐漸下降，且敲除circINPP4B后miR-30a的表達顯著增加，FISH結果顯示circINPP4B和miR-30a具有明顯的共定位，RIP的結果表明circINPP4B和miR-30a都在AGO2抗體中顯著富集，且circINPP4B探針可以顯著下拉miR-30a序列；最后，雙熒光素酶實驗結果顯示miR-30a可以顯著下調野生型circINPP4B的熒光素酶活性，但對circINPP4B突變體沒有影響?？傊?，以上結果表明circINPP4B可海綿吸附miR-30a。
圖5 CircINPP4B作為miR-30a的海綿
6、CircINPP4B通過miR-30a調控Th17細胞分化
作者之前的研究表明miR-30a可在體內外抑制Th17細胞分化通過靶向IL-21R。因此，這里作者評估了circINPP4B/miR-30a軸對Th17細胞分化的影響。挽救實驗的結果顯示，在Th17誘導過程中，miR-30a抑制Th17形成，但是circINPP4B通過增加IL-17+的比例和Th17相關細胞因子的分泌以及Rorγt和IL-21R促進Th17的分化（圖6A-D）。此外，circINPP4可以部分反轉miR-30a的抑制作用，即與過表達miR-30a組比較，共過表達circINPP4B和miR-30a組顯著增加了Th17細胞分化。鑒于圖3I顯示沉默circINPP4B后IL-21的水平顯著下降，因此為了確定IL-21下調是否是導致Th17細胞分化抑制的原因之一，作者在培養(yǎng)基中加入了外源性IL-21，結果顯示當circINPP4B敲除時外源IL-21不能增加Th17的比例，因此，與IL-21無關?？傊?，以上結果表明circINPP4B通過阻礙miR-30a對IL-21R的抑制作用促進Th17分化。
圖6 CircINPP4B通過miR-30a調控Th17細胞分化
綜上所述，如圖7，本研究使用轉錄組芯片篩選了EAE不同階段小鼠中差異表達的circRNAs，并鑒定出circINPP4B，它可以通過海綿吸附miR-30a調控Th17的分化和EAE的發(fā)展。
圖7 circINPP4B/miR-30a/IL-21R軸在EAE進展中調控Th17細胞分化的原理模型。miR-30a是Th17分化中的負調控因子，其表達被circINPP4B吸收。紅星表示作者之前的結果。紅色問號代表了本研究的研究重點。
參考文獻：
Han Jingjing., Zhuang Wei., Feng Wanhua., Dong Fuxing., Hua Fang., Yao Ruiqin., Qu Xuebin.(2021). The circular RNA circINPP4B acts as a sponge of miR-30a to regulate Th17 cell differentiation during progression of experimental autoimmune encephalomyelitis. Cell Mol Immunol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41423-021-00748-y