circPDE3B促進(jìn)食管癌進(jìn)展

越來越多的證據(jù)表明，circRNAs作為功能性RNA在各種癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，大多數(shù)circRNA參與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的機(jī)制仍未明確，其介導(dǎo)的分子機(jī)制也大多不清楚。小編給大家分享2021年7月發(fā)表于“CELL DEATH & DISEASE”（IF=8.469）的文章“Circular RNA hsa_circ_0000277 sequesters miR-4766-5p to upregulate LAMA1 and promote esophageal carcinoma progression”。在這里，我們篩選了circRNA在ESCC組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，hsa_circ_0000277(稱為circPDE3B)在ESCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加。circPDE3B在ESCC患者中的高表達(dá)與晚期TNM分期和預(yù)后不佳相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)表明，circPDE3B在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)ESCC細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。circPDE3B可以作為ceRNA，通過miR4766-5p來消除對(duì)LAMA1的抑制作用。此外，LAMA1在ESCC組織中顯著上調(diào)，并與侵襲性致癌表型呈正相關(guān)。更重要的是， circPDE3B在ESCC中的致癌作用部分依賴于miR-4766-5p/LAMA1軸。生物信息學(xué)分析結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)激活參與了circPDE3B-miR-4766-5p /LAMA1軸在ESCC中的致癌功能。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）circPDE3B在ESCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)

我們使用circRNA微陣列分析了三對(duì)ESCC組織樣本來研究ESCC組織的circRNA表達(dá)譜。與匹配的非腫瘤組織相比，ESCC組織中hsa_circ_0000277(也稱為circPDE3B)的表達(dá)顯著增加(圖1A，B)。將PDE3B mRNA序列與來自circBase的預(yù)期circPDE3B序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)circPDE3B是環(huán)狀的，包含其親本基因的2-4外顯子(圖1C)。我們使用Sanger測(cè)序來確認(rèn)頭尾拼接(圖1D)。RT-PCR表明circPDE3B只能在cDNA中擴(kuò)增，而不能在gDNA中擴(kuò)增(圖1E)。我們使用RNase R來確認(rèn)circPDE3B的穩(wěn)定性。RNase R顯著降低PDE3B線性形式的水平，但不消化circPDE3B(圖1F)。對(duì)放線菌素D的抗性也證實(shí)了circPDE3B的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1G)。接下來，我們通過qRT-PCR研究circPDE3B在ESCC細(xì)胞株中的表達(dá)。circPDE3B在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)(圖1H)。此外，qRT-PCR檢測(cè)到92對(duì)ESCC樣本中circPDE3B的表達(dá)高于相鄰正常樣本(圖1I)。原位雜交(ISH)也證實(shí)circPDE3B表達(dá)升高(圖1J)。因此，我們隨后的實(shí)驗(yàn)聚焦于circPDE3B在ESCC進(jìn)展中的作用。

2）circPDE3B表達(dá)上調(diào)與ESCC臨床預(yù)后不良相關(guān)

為了研究circPDE3B表達(dá)與ESCC臨床病理特征的相關(guān)性，我們將92例ESCC患者分為低circPDE3B表達(dá)組和高circPDE3B表達(dá)組。采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估兩組間的臨床病理因素。圖2A-C顯示較高的circPDE3B表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、晚期 TNM分期和較差的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。無病生存率(DFS)的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示，circPDE3B表達(dá)是一個(gè)重要的預(yù)后因素(圖2D)。此外，Kaplan-Meier分析顯示，與circPDE3B低表達(dá)的患者相比，circPDE3B高表達(dá)的ESCC患者表現(xiàn)出較差的OS和DFS率(圖2E, F)。這些結(jié)果表明，circPDE3B上調(diào)參與了ESCC的進(jìn)展，可能是一個(gè)潛在的預(yù)后靶點(diǎn)。

3）circPDE3B促進(jìn)體外ESCC細(xì)胞生長和侵襲

我們使用功能缺失和功能獲得策略來研究circPDE3B在ESCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能。CCK-8結(jié)果表明circPDE3B敲低顯著抑制了TE-1和EC9706細(xì)胞的增殖能力(圖3A)。菌落形成實(shí)驗(yàn)表明，circPDE3B對(duì)保持高的菌落形成能力有重要影響(圖3B)。同樣，EdU實(shí)驗(yàn)表明，circPDE3B敲低抑制了ESCC細(xì)胞的DNA合成率(圖3C)。Transwell分析顯示，與sh-NC(陰性對(duì)照)組相比，sh-circPDE3B組遷移和侵襲的細(xì)胞明顯更少(圖3D)。此外，circPDE3B過表達(dá)與細(xì)胞生長能力顯著增加相關(guān)(圖3E-G)，并大大增強(qiáng)TE-10和KYSE-410細(xì)胞的遷移和侵襲潛能(圖3H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circPDE3B在體外可促進(jìn)細(xì)胞增殖，顯著增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲和遷移。

4）circPDE3B在內(nèi)促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長和侵襲

我們通過在裸鼠右側(cè)皮下注射circPDE3B基因敲除的EC9706細(xì)胞建立異種移植瘤模型，并注射小鼠側(cè)尾靜脈建立肺轉(zhuǎn)移模型，驗(yàn)證沉默circPDE3B對(duì)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。我們使用活體成像系統(tǒng)每3天動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長情況。circPDE3B敲低導(dǎo)致皮下腫瘤中的熒光信號(hào)顯著降低(圖4A)。腫瘤在接種circPDE3B敲低EC9706細(xì)胞的小鼠中發(fā)展更慢(圖4 B，C)。qRT-PCR檢測(cè)到在circPDE3B沉默的異種移植瘤中較低的circPDE3B表達(dá)(圖4D)。此外，與陰性對(duì)照相比，circPDE3B沉默的異種移植瘤具有更少的Ki-67陽性核(圖4E)。與NC細(xì)胞相比，接種circPDE3B沉默的EC9706細(xì)胞的小鼠的肺微轉(zhuǎn)移灶更少、更小(圖4F)。綜上所述，circPDE3B敲低可以抑制ESCC細(xì)胞的生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移潛能。

5）circPDE3B通過海綿化miR-4766-p發(fā)揮其功能

FISH顯示circPDE3B主要定位于細(xì)胞質(zhì)。因此，我們進(jìn)一步探討了circPDE3B是否在ESCC細(xì)胞中海綿miRNAs。我們通過starBase和circBank將circPDE3B序列miRNA識(shí)別元件的預(yù)測(cè)結(jié)果重疊，選擇兩個(gè)候選miRNA(圖5A)。然后，我們檢測(cè)候選miRNAs是否可以直接結(jié)合circPDE3B。qRT-PCR顯示，在ESCC細(xì)胞中，miR-4766-5p而非miR-2114-3p顯著下調(diào)了circPDE3B的表達(dá)(圖5B, C)。circPDE3B過表達(dá)降低了miR-4766-5p的表達(dá)，而circPDE3B敲低則增強(qiáng)了miR-4766-5p的表達(dá)(圖5D)。我們還預(yù)測(cè)了miR-4766-5p和circPDE3B結(jié)合位點(diǎn)(圖5E)，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circPDE3B熒光素酶強(qiáng)度。miR-4766-5p顯著抑制了野生型circPDE3B的熒光素酶強(qiáng)度，但突變型circPDE3B未受影響(圖5F)。此外，AGO2免疫沉淀分析表明，與NC組相比，miR-4766-5p捕獲的部分具有circPDE3B的>5倍富集(圖5G)。與正常組織相比，ESCC組織中miR-4766-5p的表達(dá)顯著降低(圖5H)。ESCC組織中miR-4766-5p與circPDE3B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖5I)。在驗(yàn)證了circPDE3B與miR-47665p之間的相互作用后，我們檢測(cè)了circPDE3B的致癌功能是否歸因于其對(duì)miR-4766-5p的抑制作用。miR-4766-5p過表達(dá)顯著抑制了轉(zhuǎn)染的TE-1和EC9706細(xì)胞的增殖能力，而與circPDE3B載體共轉(zhuǎn)染部分逆轉(zhuǎn)了抑制作用(圖5J，K)。circPDE3B上調(diào)逆轉(zhuǎn)了異位miR-4766-5p表達(dá)導(dǎo)致的遷移和侵襲性細(xì)胞數(shù)量的減少(圖5L，M)。這些結(jié)果表明，circPDE3B至少部分通過調(diào)節(jié)miR-4766-5p來促進(jìn)ESCC細(xì)胞的侵襲性致癌表型。

6）circPDE3B通過miR-4766-5p調(diào)控LAMA1

我們使用了TargetScan和starBase來識(shí)別miR-4766-5p的假定靶基因，同時(shí)根據(jù)TCGA)析篩選出ESCC組織中上調(diào)的候選mRNA。我們選擇10種候選mRNA (ALX1, CENPK, DNMT3B, ELOVL2, FNDC1, GINS1, HELLS, LAMA1, ONECUT2, RTKN2)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖6A)。miR-4766-5p調(diào)節(jié) LAMA1、ELOVL2和ONECUT2的mRNA水平(圖6B)，但與NC相比，僅LAMA1的蛋白水平有顯著變化(圖6C)。我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，以確認(rèn)LAMA1和miR4766-5p是否直接相互作用。轉(zhuǎn)染的miR-4766-5p和野生型LAMA1的熒光素酶報(bào)告基因活性顯著降低，而突變型LAMA1的熒光素酶報(bào)告基因活性沒有明顯改變(圖6D)。此外，通過相關(guān)性分析，miR-4766-5p與LAMA1在ESCC組織中呈負(fù)相關(guān)，提示可能存在結(jié)合能力(圖6E)?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)circPDE3B通過海綿miR-4766-5p調(diào)控LAMA1的表達(dá)。qRT-PCR和western blotting結(jié)果顯示，在ESCC細(xì)胞中，circPDE3B敲低顯著降低了LAMA1的表達(dá)，而circPDE3B強(qiáng)制表達(dá)顯著增強(qiáng)了LAMA1的表達(dá)(圖6F，G)。拯救實(shí)驗(yàn)顯示，miR-4766-5p模擬物部分逆轉(zhuǎn)了circPDE3B過表達(dá)對(duì)LAMA1表達(dá)的啟動(dòng)子效應(yīng)(圖6H)。此外，circPDE3B和LAMA1在ESCC組織中表達(dá)的相關(guān)性研究顯示二者顯著正相關(guān)(圖6I)。同時(shí)，LAMA1較強(qiáng)的免疫組化染色強(qiáng)度與ESCC組織中circPDE3B表達(dá)升高呈正相關(guān)(圖6J)。總之，我們的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了我們的假設(shè)，circPDE3B海綿miR-4766-5p，隨后增加LAMA1的表達(dá)。

7）circPDE3B的致癌作用部分依賴于LAMA1

為了研究LAMA1在ESCC侵襲表型中的作用，我們進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果表明LAMA1在ESCC細(xì)胞系(圖7A)和組織(圖7B)中過表達(dá)。TCGA ESCC數(shù)據(jù)集也得到了類似的結(jié)果(圖7C)。同樣，對(duì)10對(duì)匹配的ESCC組織和相鄰的非癌組織進(jìn)行western blotting，發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中LAMA1表達(dá)顯著上調(diào)(圖7D)。通過免疫組化研究LAMA1在組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC組織比相鄰的非癌組織具有更強(qiáng)的LAMA1染色(圖7E)。與LAMA1低表達(dá)的患者相比，LAMA1高表達(dá)的患者平均OS和DFS天數(shù)減少(圖7F)。這些結(jié)果均提示LAMA1可能在ESCC進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用。接著，我們驗(yàn)證了circPDE3B在ESCC中的致癌活性是否依賴于LAMA1。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，抑制LAMA1表達(dá)可損害細(xì)胞增殖。然而，共轉(zhuǎn)染circPDE3B載體顯著逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用(圖7G，H)。同樣，與circPDE3B載體共轉(zhuǎn)染后，LAMA1沉默誘導(dǎo)的受損細(xì)胞遷移和侵襲能力被消除(圖7I，J)。為了探討circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸對(duì)體內(nèi)ESCC生長和轉(zhuǎn)移的影響，我們建立了以下四個(gè)EC9706細(xì)胞組：NC (sh-NC)、穩(wěn)定的LAMA1敲低(sh-LAMA1)、穩(wěn)定的circPDE3B過表達(dá)(circPDE3B和sh-NC)、穩(wěn)定的circPDE3B過表達(dá)伴有LAMA1抑制(circPDE3B和sh-LAMA1)。體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)表明，與NC相比，LAMA1敲低顯著抑制了腫瘤的生長，而circPDE3B過表達(dá)極大地促進(jìn)了腫瘤的生長(圖7K)。此外，LAMA1的抑制部分消除了circPDE3B過表達(dá)對(duì)腫瘤生長的促進(jìn)作用。LAMA1沉默主要降低Ki-67的表達(dá)，circPDE3B重引入可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7L)。有趣的是，LAMA1的下調(diào)大大降低了轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和大小，而強(qiáng)化的circPDE3B表達(dá)再次抵消了這一變化(圖7M)?？偟膩碚f， circPDE3B的致癌作用部分依賴于LAMA1。

8）circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸通過激活EMT促進(jìn)ESCC進(jìn)展

我們研究了circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸參與ESCC進(jìn)展的基本機(jī)制。KEGG分析(圖8A)、GSVA(圖8B)、GSEA(圖8C)表明LAMA1高表達(dá)與EMT激活密切正相關(guān)，提示EMT可能是LAMA1在ESCC中致癌作用的原因。正如預(yù)期的那樣，western blotting顯示，LAMA1敲低后，MMP2/7/9、N-cadherin、Snail、Slug和vimentin的蛋白水平降低，E-cadherin的蛋白水平升高(圖8D，E)。此外，circPDE3B沉默后也觀察到類似的抑制作用(圖8F)。拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-4766-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了circPDE3B沉默誘導(dǎo)的EMT抑制作用(圖8F)， 然而LAMA1 siRNA共轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了circPDE3B過表達(dá)誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)作用?？傊?，circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸通過激活EMT促進(jìn)ESCC進(jìn)展。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明，circPDE3B在食管鱗癌組織中上調(diào)，circPDE3B高表達(dá)是食管鱗癌患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素。CircPDE3B通過miR-4766-5p來促進(jìn)LAMA1的表達(dá)，從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。circPDE3B-miR-4766-5p LAMA1軸通過激活EMT調(diào)控ESCC進(jìn)展。circPDE3B miR-4766-5p LAMA1軸因此可能作為食管鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。