不孤單的lncRNA Tug1需要PGC1α一起保護(hù)腎臟

在涉及線粒體功能障礙的多種潛在機(jī)制中，作者發(fā)現(xiàn)lncRNA Tug1(?；撬嵘险{(diào)基因1)的異常表達(dá)在促進(jìn)DN線粒體功能障礙中起核心作用，但其分子基礎(chǔ)尚不清楚。lncRNA Tug1與低表達(dá)的足細(xì)胞Pgc1α(一種線粒體生物發(fā)生的特征明確的主調(diào)控因子)之間存在關(guān)聯(lián)，但其在體內(nèi)的作用機(jī)制尚不清楚，并且缺乏關(guān)于PGC1α作為Tug1下游效應(yīng)體在DN動(dòng)物模型中的作用的確切證據(jù)。本文建立了一個(gè)三重突變的糖尿病小鼠模型，并結(jié)合代謝組學(xué)分析數(shù)據(jù)來研究Tug1與過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC1α)的相互作用是否在體內(nèi)線粒體重構(gòu)和DN進(jìn)展中所必需。本文于2021年8月發(fā)表在《Cell Reports》IF：9.423期刊上。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1、足細(xì)胞條件性PGC1α缺失不會(huì)夸大DN進(jìn)展

為了確定在Tug1轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的腎保護(hù)特征是否歸因于PGC1α，檢測了Tug1和PGC1α在線粒體重塑和DN進(jìn)展方面的遺傳相互作用的可能性。如圖1A-1C所示，作者通過小鼠雜交構(gòu)建了足細(xì)胞中PGC1α特異性敲除的小鼠，命名為Pgc1α^f/f小鼠。此前，與非誘導(dǎo)糖尿病對(duì)照組相比，三苯氧胺誘導(dǎo)的糖尿病Pgc1α^Pod-f/f小鼠的蛋白尿量或關(guān)鍵組織學(xué)沒有顯著改變，包括系膜基質(zhì)擴(kuò)張和足細(xì)胞損失，通過ACR、Wilms腫瘤蛋白1 (WT1)、和PAS染色等測定（圖1D-1G）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，在他莫西芬誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的糖尿病Pgc1α^Pod-f/f小鼠中，線粒體超微結(jié)構(gòu)檢查顯示了相似的線粒體形態(tài)變化，具有相似的長徑比(AR)和形狀因子(FF)值（圖1H-1J）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在糖尿病環(huán)境中，足細(xì)胞特異性缺失Pgc1α不會(huì)加劇DN的進(jìn)展或線粒體功能障礙。作者對(duì)這些發(fā)現(xiàn)的解釋是，由于PGC1α在DN中已經(jīng)下調(diào)，進(jìn)一步下調(diào)其表達(dá)不會(huì)改變糖尿病腎病的進(jìn)程或線粒體形態(tài)。

圖1足細(xì)胞中條件性和誘導(dǎo)性PGC1α的缺失不會(huì)加重DN的進(jìn)展

2、在體內(nèi)，PGC1α是Tug1腎保護(hù)所必須的

作者之前已經(jīng)證明，在幾種糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，足?xì)胞中Tug1的表達(dá)降低，糖尿病小鼠足細(xì)胞特異性過表達(dá)Tug1改善了與DN相關(guān)的生化和組織學(xué)特征。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明在糖尿病環(huán)境中PGC1α可以作為Tug1的靶點(diǎn)。因此，接下來作者在體內(nèi)糖尿病環(huán)境中，探討足細(xì)胞特異性lncRNA Tug1過表達(dá)的腎保護(hù)作用是否需要PGC1α。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者構(gòu)建了條件誘導(dǎo)性糖尿病db/db模型小鼠：Tug^PodTg和Pgc1α^Pod-f/f突變小鼠（圖2A）。三重突變的糖尿病小鼠分三組，如下：db/db/Pgc1α^Pod-f/f，未誘導(dǎo)糖尿病db/db/Tug^PodTg/Pgc1α^Pod-f/f，三苯氧胺誘導(dǎo)糖尿病db/db/ Tug^PodTg/Pgc1α^Pod-f/f組。如預(yù)期的，對(duì)糖尿病Tug^PodTg小鼠足細(xì)胞的qPCR分析顯示，Tug1在不依賴于PGC1α的足細(xì)胞中表達(dá)顯著增加（圖2B）。觀察到三組患者的體重和血糖變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C-2D）；然而，足細(xì)胞中Tug1過表達(dá)導(dǎo)致蛋白尿減少和腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張（圖2E-2H）。Tug1過表達(dá)的這些有益作用在三苯氧胺誘導(dǎo)的三重突變的糖尿病小鼠Tug^PodTg/Pgc1α^Pod-f/f老鼠中部分逆轉(zhuǎn)。透射電鏡顯示，Pgc1α敲除可以減輕Tug1過表達(dá)對(duì)足細(xì)胞足突消除和GBM增厚的影響（圖2G-2J）。此外，Tug1過表達(dá)小鼠腎小球中足細(xì)胞數(shù)量的增加在三苯氧胺誘導(dǎo)的糖尿病db/db/ Tug^PodTg/Pgc1α^Pod-f/f小鼠中減少約85% （圖2G-2I）。

圖2 在糖尿病db/db模型中，足細(xì)胞特異性PGC1α缺失可減輕足細(xì)胞特異性lncRNA Tug1轉(zhuǎn)基因小鼠的腎保護(hù)作用

作者接下來探究在體內(nèi)，Tug1對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的影響是否也由PGC1α介導(dǎo)，主要探究線粒體的4個(gè)功能：線粒體生物發(fā)生，動(dòng)力學(xué)，氧化還原和生物能。線粒體超微結(jié)構(gòu)顯示，與未誘導(dǎo)糖尿病的小鼠相比，三苯氧胺誘導(dǎo)的糖尿病TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠足細(xì)胞中線粒體碎片增多，AR和FF顯著下降（圖3A-3D）。鑒于線粒體的形態(tài)變化，接下來檢測融合和裂變調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化。線粒體融合蛋白包括Drp1，Mff，MiD49和MiD51都顯著下降，但是線粒體融合關(guān)鍵組分Mfn1和Mfn2上調(diào)在Tug1轉(zhuǎn)基因小鼠中（圖3E），表明Tug1過表達(dá)增強(qiáng)線粒體融合減少片段化；但在誘導(dǎo)的db/db/TugPodTg/Pgc1αPod-f/f小鼠中，Tug1的保護(hù)作用在Pgc1α敲除后被消減，提示Pgc1α是Tug1調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)所必須的。與此一致，相對(duì)于Tug1過表達(dá)聯(lián)合Pgc1α敲低的糖尿病小鼠的足細(xì)胞，Tug1過表達(dá)對(duì)線粒體生物發(fā)生的影響發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，如線粒體拷貝數(shù)評(píng)估，線粒體ROS和總ATP含量（圖3F-3H）。

隨后通過檢測氧耗率(OCR)和細(xì)胞外酸化率(ECAR)評(píng)估Tug1/Pgc1α軸對(duì)線粒體生物能的影響。與對(duì)照未誘導(dǎo)db/db/Pgc1α^Pod-f/f足細(xì)胞相比，基礎(chǔ)呼吸和最大OCR在Tug1過表達(dá)組都顯著升高；在Tug1過表達(dá)的糖尿病小鼠足細(xì)胞中沉默Pgc1α可以阻止上述改變（圖3I-3K）。根據(jù)ECAR評(píng)估，Tug1過表達(dá)的足細(xì)胞的基礎(chǔ)糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)備比對(duì)照非誘導(dǎo)的db/db/Pgc1α^Pod-f/f足細(xì)胞顯著降低，雖然在基礎(chǔ)酸化率和糖酵解儲(chǔ)備方面沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但糖酵解能力的下降在Tug1過表達(dá)聯(lián)合Pgc1α敲低的糖尿病小鼠的足細(xì)胞中被逆轉(zhuǎn)（圖3L-3O）。

總之，這些結(jié)果表明Pgc1α是Tug1保護(hù)線粒體和減緩DN進(jìn)展所必須的。

圖3 lncRNA Tug1介導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體適應(yīng)被PGC1α敲除反轉(zhuǎn)

3、尿素循環(huán)中間體連接Tug1/PGC1α軸與線粒體重塑

已知細(xì)胞在響應(yīng)外部代謝信號(hào)時(shí)表現(xiàn)出代謝重塑，其特征是通過在底物和/或代謝途徑之間的轉(zhuǎn)換來適應(yīng)代謝需求的變化。為了進(jìn)一步了解Tug1在關(guān)鍵代謝途徑中的作用，作者重新分析了他們之前釋放的足細(xì)胞無偏性比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)分為Tug1-knockdown (shTug1)和scramble short hairpin RNA (shRNA) control (shCtrl) 兩組，該結(jié)果為糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化(OXPHOS)中酶催化反應(yīng)的一系列mRNA變化提供了一些早期線索（圖4A）。接下來，對(duì)全細(xì)胞和線粒體代謝物進(jìn)行代謝組分析。在測定的糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸的中間體中，作者發(fā)現(xiàn)尿素循環(huán)（也被稱為精氨酸-瓜氨酸循環(huán)）的中間體在最顯著被改變的，在Tug1-KD和Tug1-KD/Pgc1-OE細(xì)胞中（圖4B）。Tug1-KD細(xì)胞中，與對(duì)照組比，尿素循環(huán)的兩種中間產(chǎn)物鳥氨酸和瓜氨酸是上調(diào)最顯著的代謝物，與Tug1-KD細(xì)胞比較，它們是Tug1-KD/Pgc1-OE足細(xì)胞中下調(diào)最顯著的代謝物，提示Tug1/PGC1α軸對(duì)這兩種關(guān)鍵代謝物具有調(diào)節(jié)作用(圖4C-4D)。代謝產(chǎn)物富集分析也表明嘧啶代謝，尿素循環(huán)的下游副產(chǎn)物和精氨酸的生物合成是富集最多的途徑(圖4E和4F)。

圖4尿素循環(huán)中間體連接Tug1/PGC1α軸與線粒體重塑

為探究Tug1/PGC1α軸如何調(diào)節(jié)鳥氨酸和瓜氨酸的代謝，評(píng)估了尿素循環(huán)中的幾個(gè)關(guān)鍵酶，包括精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)，精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)，精氨酸酶1和精氨酸酶2 (ARG1和ARG2)，以及一氧化氮合成酶(NOS1, NOS2和NOS3)。在Tug1-KD細(xì)胞中，ARG2高表達(dá)，ASS1、ASL、ARG1和NOS2低表達(dá)，而Pgc1-OE逆轉(zhuǎn)了Tug1-KD對(duì)這些酶表達(dá)的影響（圖5A-5B）。作者著重關(guān)注線粒體ARG2酶，認(rèn)為增強(qiáng)ARG2表達(dá)/活性可能將Tug1/PGC1α軸的一些線粒體效應(yīng)與鳥氨酸和線粒體代謝物的增加聯(lián)系起來。與對(duì)照組相比，Tug1-KD組精氨酸酶活性增加，但是Tug1-KD/Pgc1-OE足細(xì)胞中回落（圖5C）。在互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，所得結(jié)果與此相反，Tug1過表達(dá)導(dǎo)致精氨酸酶活性下降，但是足細(xì)胞特異性Pgc1α敲除小鼠廢除了這種效應(yīng)（圖5D）。在三苯氧胺誘導(dǎo)的db/db/Tug^PodTg/Pgc1α^Pod-f/f小鼠足細(xì)胞中使用siRNA干擾Arg2基因的表達(dá)，結(jié)果顯示ATP和生物能與siRNA-NC對(duì)照組無差別（圖5E-5F），但是線粒體生物發(fā)生，ROS產(chǎn)生和動(dòng)力學(xué)（圖5G-5J）都顯著改變。這提示ARG2部分介導(dǎo)Tug1/PGC1α軸的線粒體效應(yīng)。

總之，以上結(jié)果表明Tug1/PGC1α軸依賴于尿素循環(huán)代謝和ARG2活性進(jìn)而影響足細(xì)胞線粒體代謝以適應(yīng)糖尿病環(huán)境。

圖5線粒體Arg2將Tug1/PGC1α軸與線粒體代謝連接起來

總之，本研究證明在體內(nèi)lncRNA Tug1對(duì)足細(xì)胞線粒體功能和糖尿病腎病進(jìn)展的保護(hù)作用需要PGC1α。研究發(fā)現(xiàn)，改變尿素循環(huán)代謝物和線粒體精氨酸酶2 (Arg2)在Tug1/PGC1α誘導(dǎo)的線粒體重塑中發(fā)揮重要作用。

圖形摘要

參考文獻(xiàn)：

Li Li., Long Jianyin., Mise Koki., Galvan Daniel L., Overbeek Paul A., Tan Lin., Kumar Shwetha V., Chan Wai Kin., Lorenzi Phillip L., Chang Benny H., Danesh Farhad R.(2021). PGC1α is required for the renoprotective effect of lncRNA Tug1 in vivo and links Tug1 with urea cycle metabolites. Cell Rep, 36(6), 109510. doi:10.1016/j.celrep.2021.109510