circPLCE1編碼的NF-κB調(diào)控因子抑制結直腸癌進展

NF-κB信號的組成性激活在結直腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。然而，NF-κB信號通路過度激活的潛在機制在很大程度上尚不清楚。circPLCE1編碼的一種新蛋白circPLCE1-411被鑒定為NF-κB激活的關鍵蛋白。機制上，circPLCE1-411通過直接結合HSP90α/RPS3復合物促進RPS3從復合物中分離，促進了關鍵NF-κB調(diào)節(jié)因子RPS3的泛素依賴性降解，從而減少了CRC細胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位。在功能上，circPLCE1抑制CRC細胞中的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，以及患者來源的異種移植瘤和原位異種移植瘤模型。臨床上，circPLCE1在CRC組織中下調(diào)，并與晚期臨床階段和低生存率相關。本文于2021年8月發(fā)表在Molecular Cancer（IF=27.401）期刊上。

技術路線

結果：

1）CRC中circPLCE1的特征及臨床意義

為了識別CRC中差異表達的circRNA，我們使用正常的人類腸道上皮細胞系和CRC細胞系進行了總RNA測序。我們確定研究對象為circPLCE1 (hsa_circ_0019223，命名為circPLCE1)。我們分析了85對CRC樣本中的circPLCE1表達，證實了88.2%(75/85)的CRC患者中circPLCE1表達下調(diào)(圖1A和B)。進一步分析顯示，circPLCE1在晚期臨床期或T期患者中表達下調(diào)(圖1C和D)。使用qRT-PCR分析circPLCE1在正常人腸上皮細胞株和CRC細胞株中的表達水平差異，得到了相似的結果(圖1E)。circPLCE1由PLCE1外顯子2反向剪接而成。通過Sanger測序證實了circPLCE1的反向拼接連接(圖1F)。PLCE1的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本只能通過擴增引物在cDNA中擴增(圖1G)。circPLCE1還能抵抗RNase R酶切(圖1G和H)。半衰期試驗進一步表明，circPLCE1比circPLCE1線性mRNA更穩(wěn)定(圖1I)。通過核質(zhì)量分離試驗和熒光原位雜交(FISH)檢測了circPLCE1的定位，結果顯示circPLCE1在CRC細胞的細胞質(zhì)中富集(圖1J和K)。此外，circPLCE1在臨床晚期或T期患者中表達較低(圖1L)。Kaplan Meier曲線結果顯示，CRC患者circPLCE1表達較低與較差的生存率相關(圖1M)。這些數(shù)據(jù)驗證了circPLCE1的特征和臨床意義。

2）circPLCE1體外抑制CRC細胞增殖和遷移

為了闡明circPLCE1在CRC中的功能，我們構建了穩(wěn)定過表達circPLCE1的CRC細胞系。circPLCE1過表達抑制了CRC細胞集落形成、球體形成和不依賴于錨定的生長(圖2A-C)。此外，我們在兩個患者來源的器官(PDOs)中過表達了circPLCE1，結果也表明，circPLCE1降低了PDOs的生長(圖2D)。過表達circPLCE1也抑制細胞遷移和侵襲(圖2E和F)。此外，circPLCE1敲低顯著促進了CRC細胞的生長、遷移和侵襲(圖2G-K)。綜上所述，circPLCE1在CRC細胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

3）circPLCE1編碼一種新的蛋白circPLCE1–411

為了研究CRC中circPLCE1的詳細機制，我們首先使用編碼潛能評估工具分析了circPLCE1的編碼潛能，提示circPLCE1的蛋白編碼概率大于0.999。接下來，我們分析了circPLCE1的ORF。在circPLCE1中存在一個潛在的跨越連接ORF編碼一個411氨基酸蛋白(以下簡稱circPLCE1-411，圖3A)。通過雙熒光素酶分析驗證了驅(qū)動ORF翻譯的內(nèi)部核糖體進入位點的活性(圖3B)。接下來，我們構建了flag標記的質(zhì)粒以確定circPLCE1-411的存在。通過qRT-PCR檢測circPLCE1和線性PLCE1的表達(圖3C)。此外，我們發(fā)現(xiàn)PLCE1抗體在circPLCE1-411中具有相同的免疫原序列(圖3D)。Western blot結果顯示，在不影響PLCE1表達的情況下，PLCE1和flag抗體可在50 kDa左右檢測到circPLCE1-411 (圖3E)。此外，qRT-PCR和western blot檢測表明，circPLCE1或circPLCE1-411并不影響PLCE1的含量(圖3C和E)。為了鑒定該蛋白，我們用轉(zhuǎn)染了flag標記的circPLCE1載體的細胞裂解液進行免疫沉淀分析(圖3F和G)。結果證明circPLCE1編碼了這種新蛋白(圖3H)。為了探索circPLCE1-411的潛在臨床意義，我們通過western blot分析了CRC樣本和正常鄰近組織中circPLCE1-411的表達。結果顯示，circPLCE1-411在大多數(shù)CRC組織中下調(diào)(圖3I)。此外，circPLCE1-411表達與腫瘤的臨床分期和T分期呈負相關(圖3J和K)。

4）circPLCE1通過編碼circPLCE1-411抑制CRC細胞增殖和遷移

為了探索circPLCE1-411的生物學功能，我們進行了細胞實驗。結果表明，轉(zhuǎn)染circPLCE1或circPLCE1-411的CRC細胞可抑制集落形成、球的形成、不依賴于錨定的生長和PDOs生長。然而，用帶有起始密碼子突變體的circPLCE1載體(circPLCE1-ATGmut)轉(zhuǎn)染對CRC細胞增殖沒有影響(圖4A-H)。此外，細胞遷移和傷口愈合實驗也顯示，轉(zhuǎn)染circPLCE1或circPLCE1-411載體可抑制CRC細胞遷移和侵襲，而轉(zhuǎn)染circPLCE1-ATGmut對CRC細胞遷移沒有影響(圖4I-L)。這些數(shù)據(jù)表明，circPLCE1通過編碼circPLCE1-411而不是circPLCE1的circRNA形式來抑制CRC細胞的增殖和遷移。

5）circPLCE1 - 411與HSP90α/RPS3復合物結合，促進泛素依賴的RPS3降解，抑制NF - κB信號通路

根據(jù)前期研究和相關文獻我們推測circPLCE1-411可能與HSP90α/RPS3復合物結合，調(diào)控NF-κB信號通路，從而抑制CRC的進展。我們在HCT8和DLD1細胞中通過免疫沉淀鑒定了circPLCE1-411和HSP90α/RPS3復合物之間的相互作用(圖5A)。我們發(fā)現(xiàn)RPS3蛋白水平隨著circPLCE1-411表達的增加而顯著降低(圖5B，上)。然而，RPS3 mRNA水平的豐度并沒有隨著circPLCE1-411表達的增加而改變(圖5B，底部)。這提示circPLCE1-411可能通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控RPS3。經(jīng)蛋白合成抑制劑環(huán)己亞胺CHX處理后，與對照組相比，HCT8和DLD1細胞中RPS3蛋白降解更快，circPLCE1-411表達增加(圖5C)。此蛋白酶體抑制劑MG132的作用減弱了circPLCE1-411對RPS3蛋白水平的影響(圖5D)。circPLCE1過表達的細胞中RPS3泛素化水平升高。相反，circPLCE1敲低后，RPS3的泛素化水平降低(圖5E)。接下來，我們用相同濃度的HA-HSP90α、HisRPS3和Myc-HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，但增加Flag-circPLCE1質(zhì)粒的濃度用于后續(xù)的免疫沉淀實驗。結果表明，隨著circPLCE1-411表達量的增加，RPS3與HSP90α的互作性降低，而與HSP70的互作性增加(圖5F)。為了鑒定HSP90α與RPS3和circPLCE1-411相互作用的結構域，我們生成了HSP90α截斷突變體，發(fā)現(xiàn)RPS3和circPLCE1-411的相互作用依賴于HSP90α的N端(圖5G)。

由于RPS3是NF-κB的重要調(diào)控因子，我們進一步分析了circPLCE1對NF-κB信號通路的影響。Western blot結果顯示，過表達circPLCE1-411導致全細胞提取物中p-P65表達降低，細胞核中P65表達下調(diào)。正如預期的那樣，核P65的DNA結合活性也減弱了。相反，circPLCE1-411敲低則上調(diào)了全細胞提取物中p-P65的蛋白水平，增加了細胞核中P65的積累，增強了細胞核中P65的DNA結合活性(圖5H-I)。綜上所述，circPLCE1-411結合HSP90α的N端，促進RPS3與HSP90α/RPS3復合物的解離，導致RPS3的泛素依賴性降解，抑制NF-κB信號。

6）circPLCE1-411在體內(nèi)抑制CRC生長和轉(zhuǎn)移

為了證實circPLCE1-411在體內(nèi)的功能，我們建立了原位異種移植瘤模型，觀察腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移情況。我們的結果顯示，載體組和circPLCE-ATGmut組均出現(xiàn)80%(4/5)的結直腸腫瘤形成，60%(3/5)和40%(2/5)的肝轉(zhuǎn)移。在circPLCE1和circPLCE1-411組中，5只小鼠中有2只(40%)形成了腫瘤較小的原位腫瘤，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移(圖6A-C)。此外，我們分析了人HPRT mRNA在肝臟中的表達，證實circPLCE1-411誘導肝轉(zhuǎn)移瘤負荷顯著增加(圖6D)。為了進一步探索這些作用，我們應用了PDX模型來評估circPLCE1-411通過腫瘤內(nèi)慢病毒注射的潛在療效。結果顯示，與載體和circPLCE-ATGmut慢病毒處理的腫瘤相比，circPLCE1或circPLCE1-411慢病毒處理的腫瘤導致腫瘤生長明顯放緩(圖6E和F)。此外，我們分離了PDX腫瘤，并通過H&E、ISH和IHC染色評估它們。并發(fā)現(xiàn)circPLCE1和circPLCE-ATGmut組的circPLCE1表達上調(diào)。circPLCE1或circPLCE1-411組中RPS3和p-P65的表達降低(圖6G和H)。綜合這些結果，我們確定了circPLCE1-411在體內(nèi)CRC腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的關鍵作用。

   結論：circPLCE1編碼的circPLCE1-411可與HSP90α/RPS3復合物結合，促進關鍵的NF-κB調(diào)控因子RPS3從復合物中解離，從而促進其泛素依賴性降解，最終導致NF-κB核易位減少。此外，circPLCE1表現(xiàn)出一種破壞NF-κB核易位的表觀遺傳機制，可作為一種新的、有前景的治療靶點和預后標志物。