CircMEMO1通過調(diào)節(jié)啟動子甲基化和TCF21的表達(dá)，進(jìn)而控制肝癌進(jìn)展和索拉非尼治療敏感性

肝細(xì)胞癌(HCC)作為一種常見的惡性腫瘤，腫瘤轉(zhuǎn)移給HCC患者預(yù)后帶來極大挑戰(zhàn)。本研究中，作者篩選出一個CircRNA，即CircMEMO1，闡明了CircMEMO1在HCC轉(zhuǎn)移中的抑制作用以及在索拉非尼治療敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制。本文于2021年5月發(fā)表在《 Molecular Cancer》雜志上，IF=15.302。

結(jié)果如下：

1．CircMEMO1 在HCC組織中表達(dá)顯著下調(diào)，與患者預(yù)后有關(guān)

作者首先將癌旁組織和肝細(xì)胞癌患者組織中的差異CircRNA進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其中28個CircRNA顯著上調(diào)，18個顯著下調(diào)，其中CircMEMO1顯現(xiàn)出顯著差異（Fig. 1a）。為進(jìn)一步對CircMEMO1進(jìn)行研究，首先對CircMEMO1進(jìn)行了擴(kuò)增（Fig. 1b ），產(chǎn)物通過Sanger測序檢測CircMEMO1存在頭尾剪接區(qū)，RNAse R耐受性檢測進(jìn)一步驗證預(yù)測的CircMEMO1為 CircRNA。

為確定CircMEMO1是否與肝細(xì)胞癌相關(guān)，作者研究了CircMEMO1在不同的HCC細(xì)胞系中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1在轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中(MHCC97H，和HCCLM3)的水平低于非轉(zhuǎn)移系(Hep3B， PLC/PRF/5，和Huh7)。進(jìn)一步研究CircMEMO1在HCC組織中的變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與癌旁樣本相比，CircMEMO1在HCC組織樣本中明顯下調(diào)（Fig. 1c），進(jìn)一步分析CircMEMO1水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1在HCC樣本中的水平血管侵入有關(guān)（Fig. 1d）。生存分析顯示，CircMEMO1高水平的HCC患者的總生存（OS）和無病生存期（DFS）明顯優(yōu)于CircMEMO1表達(dá)水平低的HCC患者（Fig. 1e，f）。多變量Cox分析顯示，HCC組織中的CircMEMO1水平是HCC患者的獨立預(yù)后因素(Fig.1g)。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1水平下調(diào)在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Figure 1 CircMEMO1在HCC組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且與患者預(yù)后相關(guān)

2． CircMEMO1在體外和體內(nèi)均能抑制肝癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲

為研究CircMEMO1在HCC進(jìn)展中的生物學(xué)功能，CircMEMO1分別通過慢病毒在HCCLM3細(xì)胞系中過表達(dá)，在Huh-7細(xì)胞系中進(jìn)行敲低處理（Fig. 2a）。細(xì)胞增殖、克隆形成和Transwell實驗表明，CircMEMO1被敲除后，Huh-7細(xì)胞的增殖、克隆生成和遷移能力顯著增強(qiáng)；在體外改變CircMEMO1水平， HCCLM3細(xì)胞系的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力削弱(Fig. 2b-g)。

為了進(jìn)一步確定CircMEMO1是否作為腫瘤抑制因子，我們將對照HCCLM3或過表達(dá)的CircMEMO1細(xì)胞注射到裸鼠中，結(jié)果顯示，在移植6周后，過表達(dá)CircMEMO1的   HCCLM3細(xì)胞形成的異種移植瘤明顯小于由對照組細(xì)胞(Fig. 2h-j)。6只裸鼠中，過表達(dá)CircMEMO1的 HCCLM3細(xì)胞中只有1個 異種移植小鼠(16.7%)肺中有轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，而對照組6只異種移植小鼠中有5只(83.3%)有肺轉(zhuǎn)移跡象(Fig.2k，l)。因此，推測CircMEMO1在體內(nèi)和體外均具有抑制腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

Figure 2 CircMEMO1在體外和體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲

3． CircMEMO1通過吞噬HCC細(xì)胞中的miR-106b-5p來調(diào)節(jié)TET/5hmC軸水平

已有研究報道，CircRNA可以作為miRNA海綿。靶基因預(yù)測顯示miR-106b-5p可能與CircMEMO1存在互作。為了研究CircMEMO1和miR-106b-5p之間的互作，作者設(shè)計了一個生物素化的線性CircMEMO1探針。qRT-PCR結(jié)果顯示，在Huh-7 和HCCLM3 細(xì)胞系中，miR-106b-5p均能被CircMEMO1探針吸附。此外，通過 miR-106b-5p來下拉Huh-7 和HCCLM3 細(xì)胞系中CircMEMO1，qRT-PCR結(jié)果也顯示miR-106b-5p能捕獲CircMEMO1 (Fig. 3a，b)。

為了進(jìn)一步闡明CircMEMO1抑制HCC進(jìn)展的分子機(jī)制，作者接下來開始鑒定miR-106b-5p的靶基因。以往的研究表明，TET基因中編碼將5位胞嘧啶(5-mC)氧化為5-羥甲基胞嘧啶的關(guān)鍵雙加氧酶，TET1和TET2在HCC組織中經(jīng)常表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)。通過在線靶基因預(yù)測算法，作者發(fā)現(xiàn)TET1和TET2是miR-106b-5p的潛在候選靶基因。

為了探討HCC細(xì)胞系中不同miR-106b-5p表達(dá)水平對TET1和TET2表達(dá)的影響，作者分別在Huh-7細(xì)胞系中過表達(dá)miR-106b-5p，在HCCLM3 細(xì)胞系中對miR-106b-5p進(jìn)行敲低處理，結(jié)果顯示，miR-106b-5p在Huh-7細(xì)胞系中上調(diào)顯著抑制TET1和TET2 mRNA和蛋白水平 (Fig. 3d)。熒光素酶報告試驗顯示野生型熒光活性顯著低于對照組(Fig. 3e)。接下來，作者檢測了5hmC和5-mC水平的變化來評估m(xù)iR-106b-5p是否可以通過靶向TET基因和調(diào)節(jié)5hmC水平來重塑表觀遺傳。正如所料，Huh-7 / miR -106b-5p-OE細(xì)胞的5hmC水平低于hu -7/Control細(xì)胞，在HCCLM3細(xì)胞系中抑制miR-106b-5p 明顯提高了5hmC的水平，但5-mC的水平?jīng)]有改變(Fig 3f，g)。

CircMEMO1充當(dāng)miR-106b-5p海綿在HCC細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能，作者進(jìn)一步檢測了不同CircMEMO1水平的HCC細(xì)胞中TET1、TET2蛋白表達(dá)和gDNA 5hmC水平的變化。結(jié)果顯示，下調(diào)CircMEMO1降低了Huh-7細(xì)胞系中TET1和TET2蛋白的表達(dá)和gDNA 5hmC的水平，而過表達(dá)CircMEMO1則增加了HCCLM3細(xì)胞系中TET1和TET2的表達(dá)和gDNA 5hmC的水平(Fig 3h，i)。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1可以充當(dāng)miR-106b-5p海綿，調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的TET/5hmc軸。

Figure 3 CircMEMO1通過海綿MiR-106b-5p調(diào)控HCC細(xì)胞中TET1/5hmC軸的水平

4． CircMEMO1水平與miR-106b- 5p/TET1/5hmC軸相關(guān)，高水平miR-106b- 5p會促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展

通過qRT-PCR分析了CircMEMO1和TET1/2 mRNA水平的相關(guān)性，作者觀察到CircMEMO1在HCC樣本中的表達(dá)水平與TET1的mRNA水平直接正相關(guān)，而與TET2的mRNA水平無關(guān)(Fig 4a， b)。這表明TET1可能在CircMEMO1引起的抑制肝癌的進(jìn)展。

為了確定TET1蛋白在HCC進(jìn)展和預(yù)測HCC患者預(yù)后中的作用，我們進(jìn)一步通過免疫組化和TMA檢測TET1蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， TET1蛋白水平高的的HCC患者預(yù)后比TET1蛋白水平低的HCC患者總生存期更長，復(fù)發(fā)率更低(Fig 4c，d)。

miR-106b-5p和5hmC作為CircMEMO1調(diào)控HCC進(jìn)展生物學(xué)功能的重要中間體，采用原位雜交和免疫組化染色的方法分別檢測HCC患者miR-106b-5p和5hmC水平之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，HCC細(xì)胞系中，miR-106b-5p高表達(dá)的在人體內(nèi)的5hmC水平較低，反之亦然(Fig 4e)。此外，HCC患者中表現(xiàn)出高水平miR-106b-5p和低水平5hmC往往預(yù)后較差，且復(fù)發(fā)率高。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1可能通過調(diào)節(jié)miR-106b-5p/TET1/5hmC軸來影響肝癌中惡性細(xì)胞的特性，并促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

Figure 4 CircMEMO1水平與miR-106b-5p/TET1/5hmC軸相關(guān)

5． CircMEMO1通過MiR-106b-5p/TET1/調(diào)控EMT過程來抑制HCC轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞特性

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。在HCC中，miR-106b-5p已被證實通過激活EMT過程促進(jìn)HCC的遷移和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)CircMEMO1可以充當(dāng)miR-106b-5p海綿，抑制HCC浸潤和進(jìn)展。這些結(jié)果提示CircMEMO1可能通過miR-106 b-5p / TET1/5hmC軸調(diào)控EMT過程來抑制HCC轉(zhuǎn)移。為了證實該假設(shè)，作者研究了HCC細(xì)胞中EMT相關(guān)分子標(biāo)記的表達(dá)。與相應(yīng)細(xì)胞相比，sh-CircMEMO1 的HCC細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)較弱，間質(zhì)標(biāo)記物Fibronectin、Vimentin和Snail表達(dá)較強(qiáng)。此外，western blotting結(jié)果證實，在HCCLM3細(xì)胞中上調(diào)CircMEMO1的表達(dá)降低了間充質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)纖維連接蛋白，波形蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，但增加了上皮標(biāo)記Ecadherin (Fig. 5a，b)。EMT過程已知與正常和惡性乳腺干細(xì)胞功能相關(guān)。我們進(jìn)一步推測CircMEMO1可能也有抑制肝癌細(xì)胞的干性。值得注意的是，下調(diào)CircMEMO1的表達(dá)可以增加Huh-7細(xì)胞形成腫瘤球結(jié)構(gòu)的能力，而過表達(dá)CircMEMO1則降低HCCLM3細(xì)胞形成腫瘤球結(jié)構(gòu)的能力(Fig. 5c)。由于CircMEMO1在人類HCC樣本中與TET1 mRNA水平直接正相關(guān)，我們進(jìn)一步試圖驗證TET1/ 5hmc軸是否在CircMEMO1或miR-106b-5p的功能中發(fā)揮直接作用。首先，TET1異位表達(dá)hu -7/sh-CircMEMO1或hu -7 miR-106b-5p-OE細(xì)胞，然后分析這些細(xì)胞的侵襲能力。我們發(fā)現(xiàn)，外源性表達(dá)TET1蛋白顯著降低了sh-CircMEMO1或miR-106b-5p過表達(dá)介導(dǎo)的增強(qiáng)的癌細(xì)胞侵襲(Fig.5d)。

Figure 5 CircMEMO1通過miR-106b-5p/TET1/5hmC軸調(diào)控EMT過程抑制HCC進(jìn)展

6．CircMEMO1通過調(diào)節(jié)DNA去甲基化與TCF21的表達(dá)

作者假設(shè)CircMEMO1和miR-106b-5p可能調(diào)節(jié)TCF21基因啟動子的去甲基化并調(diào)節(jié)其表達(dá)，導(dǎo)致其同源靶點的變化。為了探索這種可能性，首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫HCC樣本中TCF21和miR-106b-5p/CDH1水平的關(guān)系。我們的結(jié)果顯示，TCF21 mRNA水平與miR-106b-5p水平呈負(fù)相關(guān)，而與CDH1水平呈正相關(guān)(Fig. 6a，b)。此外，與正常組織相比，在包括HCC在內(nèi)的一系列癌癥中，TCF21 mRNA水平下調(diào)(Fig. 6c)，HCC患者樣品中TCF21基因啟動子甲基化水平明顯高于對照組(Fig. 6d，e)。因此，TCF21可能是一種重要的腫瘤抑制因子，在HCC樣本中由于基因啟動子甲基化異常而下調(diào)。我們進(jìn)一步檢測了不同CircMEMO1或miR-106b-5p水平的HCC細(xì)胞中TCF21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中TCF21的mRNA和蛋白表達(dá)，而miR-106b-5p可以抑制TCF21的表達(dá)(Fig. 6f, g)。hMeDIP-qPCR檢測結(jié)果顯示，在不同CircMEMO1水平下，TCF21表現(xiàn)出不同的5hmC水平(Fig.6h)。更重要的是，TCF21過表達(dá)通過抑制CircMEMO1或激活miR-106b-5p降低了轉(zhuǎn)移和EMT過程(Fig.6i, j)。這些結(jié)果表明CircMEMO1通過調(diào)控DNA啟動子去甲基化和TCF21的表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌進(jìn)展作用。

Figure 6 CircMEMO1通過調(diào)節(jié)DNA去甲基化和TCF21表達(dá)抑制肝癌進(jìn)展

7． 在HCC細(xì)胞中，CircMEMO1的水平調(diào)節(jié)抗腫瘤活性

索拉非尼作為晚期HCC患者標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但耐藥性使其臨床療效有限。研究報道HCC進(jìn)展中的EMT特性可能導(dǎo)致索拉非尼耐藥，因此作者推測，肝癌細(xì)胞中的CircMEMO1可能影響索拉非尼治療的敏感性。為了驗證這種假設(shè)，作者首先評估了索拉非尼治療后肝癌患者TCF21水平及與預(yù)后的關(guān)系。TGCA分析顯示，TCF21水平與索拉非尼治療后的HCC患者的總生存期相關(guān) (Fig.7a)。然后，分析了40例接受索拉非尼和進(jìn)行了肝切除術(shù)的晚期肝癌復(fù)發(fā)患者的回顧性數(shù)據(jù)，結(jié)果也表明TCF21水平與患者預(yù)后相關(guān)(Fig. 7b)。

隨后，作者檢測了CircMEMO1水平對的腫瘤生長和遷移能力變化的影響。索拉非尼在體外治療HCC細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，下調(diào)CircMEMO1表達(dá)可減弱10 mmol/L索拉非尼在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)的生長抑制作用，而過表達(dá)CircMEMO1可增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的生長抑制作用(Fig.7c)。Matrigel分析表明，與對照Huh-7細(xì)胞相比，低CircMEMO1水平的Huh-7細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力，而CircMEMO1在HCCLM3細(xì)胞中過表達(dá)的結(jié)果則相反(Fig. 7d)。為了進(jìn)一步確定CircMEMO1在調(diào)節(jié)索拉非尼治療敏感性中的作用，我們在上述40例晚期復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中的組織樣本中檢測了CircMEMO1和miR-106b-5p的水平，Kaplan-Meier生存分析顯示，低水平CircMEMO1組的總生存期遠(yuǎn)低于高水平CircMEMO1組，而低水平的miR-106b-5p組的總生存期遠(yuǎn)高于高水平miR-106b-5p組。因此，推斷CircMEMO1及其下游靶點miR-106b-5p可調(diào)節(jié)索拉非尼治療過程中的敏感性。

Figure 7 CircMEMO1調(diào)控索拉非尼治療肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性

circMEMO1是HCC轉(zhuǎn)移和細(xì)胞干性中是一個關(guān)鍵的腫瘤抑制因子，它通過miR-106b-5p/TET1/5hmC/TCF21軸和EMT過程發(fā)揮作用。circMEMO1作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾物，也可以調(diào)節(jié)肝癌對索拉非尼治療的敏感性。

參考文獻(xiàn)：

Dong, Z.R., et al., CircMEMO1 modulates the promoter methylation and expression of TCF21 to regulate hepatocellular carcinoma progression and sorafenib treatment sensitivity. Mol Cancer, 2021. 20(1): p. 75.