lncRNA穩(wěn)定表達后與蛋白結合促進腫瘤惡性進展

LncRNA在不同癌癥類型中異常調(diào)節(jié)被認為是人類癌癥發(fā)生和進展的重要調(diào)控元素。但是其在胃癌（GC）中的作用仍有較大空白。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA THAP7-AS1被SP1轉錄激活然后被METTL3介導的m6A修飾穩(wěn)定，進而提高CUL4B進入核中，從而發(fā)揮了原癌特性。本文于2021年10月發(fā)表在《Cell Death and Differentiation》IF：15.828期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、THAP7-AS1在伴有淋巴結轉移的胃癌樣本中上調(diào)

對10例GC樣本和2例非腫瘤胃組織進行芯片分析，獲得lncRNA的差異表達譜，包含989個上調(diào)lncRNA（圖1A）。只有2個lncRNA，LOC100133669和THAP7-AS1滿足以下條件：差異倍數(shù)大于5，P<0.05，在GC中顯著上調(diào)（圖1B）。但是在72個GC臨床樣本中，只有THAP7-AS1在淋巴結轉移（LNM）的組織中的表達顯著非LNM組織（圖1C-D）。因此被初步選為候選基因。隨后發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1同時定位于細胞核和細胞質，并能穩(wěn)定表達（圖1E-J）。

圖1 THAP7-AS1在伴有淋巴結轉移的胃癌樣本中上調(diào)

2、在GC細胞中SP1激活THAP7-AS1的轉錄

對THAP7-AS1進行啟動子分析，如圖2A-B，啟動子207區(qū)域活性顯著低于509區(qū)域，表明-509-207區(qū)域是THAP7-AS1完整轉錄活性所需要的。隨后預測了5個與THAP7-AS1結合的轉錄因子，發(fā)現(xiàn)當過表達SP1，KLF5，EGR1后THAP7-AS1啟動子509-0區(qū)域活性顯著升高，但是只有SP1可以促進THAP7-AS1的表達（圖2C-E）。為了確定SP1上3個與THAP7-AS1結合的位點的實際作用，進行了單位點突變實驗，結果顯示SP1-1，SP-1-2和SP-1-3突變質粒的THAP7-AS1啟動子的活性顯著下降，且下降倍數(shù)不同，表明3個結合位點各自獨立作用（圖2F-G）。ChIP結果顯示，SP1可以和THAP7-AS1啟動子之間結合，并且兩者的表達呈正相關（圖2H-J）。以上表明SP1結合THAP7-AS1啟動子進而激活其轉錄。

圖2（上部分）THAP7-AS1由SP1激活

3、METTL3介導m6A修飾通過IGF2BP1依賴的RNA穩(wěn)定性增強THAP7-AS1表達

m6A修飾被認為是最普遍的內(nèi)部RNA修飾，涉及到RNA的降解，穩(wěn)定性和剪切。為了評估m(xù)6A修飾在THAP7-AS1轉錄后調(diào)控中的重要作用，對THAP7-AS1序列進行了m6A修飾預測，發(fā)現(xiàn)其包含7個潛在的修飾位點。MeRIP實驗結果顯示THAP7-AS1確實存在m6A修飾（圖2K-L）。此外，過表達或敲除METTL3，而不是METTL14，可以顯著性增加或減少THAP7-AS1的水平（圖2M-P）。并且和非LNM組織比較，METTL3的表達在LNM中顯著上調(diào)，其表達和THAP7-AS1表達呈正相關關系（圖2Q-R）。RNA pull-down實驗表明THAP7-AS1可以和METTL3直接結合（圖2P-Q）。敲除IGFBP1，而不是IGFBP2-3，導致THAP7-AS1表達下降，并且敲除IGFBP1后THAP7-AS1的穩(wěn)定性下降，RIP也發(fā)現(xiàn)IGFBP1和THAP7-AS1的直接結合（圖2S-U）。此外，在METTL3沉默的GC細胞中，IGFBP1和THAP7-AS1的結合顯著下降。因此，以上表明METTL3介導的m6A修飾通過IGFBP1依賴的增強THAP7-AS1穩(wěn)定性提高其表達。

圖2（下部分）THAP7-AS1由METTL3介導的m6A修飾轉錄后穩(wěn)定

4、THAP7-AS1促進GC細胞體內(nèi)外的生長，遷移和侵襲

如圖3所示，過表達THAP7-AS1顯著促進GC細胞的增殖，遷移和侵襲，沉默則相反。在體內(nèi)，過表達THAP7-AS1增加了腫瘤體積，和肺轉移。

圖3 THAP7-AS1促進GC細胞體內(nèi)外的生長，遷移和侵襲

5、THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導CUL4B進入細胞核

近來研究表明lncRNA通過和蛋白質相互作用發(fā)揮功能，作者推測THAP7-AS1也可能是通過這種方式介導GC惡性表型。RNA pull-down和MS實驗鑒定了與THAP7-AS1結合的蛋白，包括CUL4B和STAT3（圖4A）。但是只有CUL4B在GC細胞中特異性結合THAP7-AS1（圖4B-D）。隨后，作者構建了一系列截斷突變體去探究它和CUL4B的結合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1的1-442nt區(qū)域是和CUL4B結合所必須的（圖4E）。FISH證實了兩者的共定位（圖4F），但是作者發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1并不能改變CUL4B的表達（圖5A,E），提示THAP7-AS1不參與CUL4B的轉錄后調(diào)控。有趣的是，慢病毒轉染THAP7-AS1后，細胞質中CUL4B表達減少，細胞核中CUL4B表達增加（圖4G-H），表明THAP7-AS1促進CUL4B蛋白進入細胞核。進一步研究發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1提高了NLS和importin α1的結合能力（圖4I-K），并且THAP7-AS1直接結合CUL4B的NLS區(qū)域（圖4L-O）；THAP7-AS1也可以直接結合importin α1（圖4P-S）。表明THAP7-AS1與importin α1和CUL4B的NLS區(qū)域結合，從而促進CUL4B和importin α1的結合。隨后的挽救實驗證實了THAP7-AS1的生物學功能是通過CUL4B的核易位（圖4T-U）。總之，以上表明THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導CUL4B進入細胞核，進而促進了GC細胞的惡性表型。

圖4 THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導CUL4B進入細胞核

6、THAP7-AS1/CUL4B復合物可啟動miR-22-3p/miR-320抑制PI3K/AKT信號通路

為了鑒定參與THAP7-AS1/CUL4B復合物介導的生物學功能的潛在基因，對si-THAP7-AS1和對照HC細胞進行了RNA測序。與對照相比，在THAP7-AS1/CUL4B干擾組總計獲得6502個上調(diào)基因，5794個下調(diào)基因。如圖5的WB和RT-qPCR結果所示，PI3K/AKT信號通路上的基因，包括PIK3CA，PIK3CD，AKT3，顯著響應THAP7-AS1或CUL4B的干擾或過表達處理；白合成抑制劑環(huán)己亞胺(CHX)和蛋白酶體抑制劑MG132處理實驗結果表明，THAP7-AS1/CUL4B是在轉錄后水平調(diào)控上述PI3K/AKT信號通路上的基因表達，而不影響他們的穩(wěn)定性和降解。

圖5 THAP7-AS1/CUL4B復合物啟動PI3K/AKT信號通路

鑒于miRNAs常見的轉錄后負調(diào)控因子，所以作者猜測miRNA可能參與CUL4B對PI3K/AKT信號通路上的基因表達的調(diào)控。如圖6所示，作者使用GSE數(shù)據(jù)和在線預測獲得了5個候選miRNAs，進一步驗證后鎖定了miR-22-3p/miR-320a，隨后實驗證實AKT3是miR-22-3p的靶基因，而miR-320a 可同時靶向調(diào)節(jié)PIK3CA，PIK3CD，AKT3蛋白的表達，挽救實驗也再次證實了這個結果?？傊?，以上表明THAP7-AS1/CUL4B復合物通過miR-22-3p/miR-320靶向抑制PI3K/AKT信號通路。

圖6 THAP7-AS1/CUL4B復合物可啟動miR-22-3p/miR-320a抑制的PI3K/AKT信號通路

7、THAP7-AS1/CUL4B復合物轉錄抑制miR-22-3p/miR-320a表達通過CUL4B催化H2AK119ub1和EZH2介導的H3K27me3

研究發(fā)現(xiàn)CUL4B通過單泛素化H2AK119調(diào)控腫瘤抑制子的表觀遺傳失活。EZH2是PRC2的催化亞基，對于形成穩(wěn)定的、酶活性強的甲基轉移酶復合物至關重要。為了檢測miR-22-3p和miR320a的表達是否受到上述表觀遺傳修飾的調(diào)控，用5-AZ、TSA和Dznep處理GC細胞，結果發(fā)現(xiàn)它們的表達在TSA和Dznep組顯著上調(diào)（圖7A-B），表明其啟動子存在組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化?？笴UL4B、EZH2、H2AK119ub1、H3K27me3、HDAC1和HADC2或對照IgG的ChIP檢測顯示，CUL4B(圖7C, G)、EZH2(圖7D, H)、H3K27me3(圖7E, I)和H2AK119ub1(圖7F, J)，有效地免疫沉淀了miR-22-3p和miR-320a的啟動子區(qū)域，表明它兩可被CUL4B催化的單泛素化H2AK119和PRC2-介導的H3K27me3調(diào)控。

敲除CUL4B導致CUL4B，EZH2，H3K27me3，H2AK119ub1綁定到miR-22-3p和miR-320a啟動子顯著減少。這表明CUL4B調(diào)節(jié)miR-22-3p和miR320a的轉錄抑制是通過招募PRC2（圖7K-R）。THAP7-AS1過表達導致與miR-22-3p和miR-320a啟動子結合的CUL4B和EZH2顯著增加，表明THAP7-AS1參與了CUL4B介導的PRC2招募（圖7S-V）。CUL4B敲低逆轉了THAP7- AS1過表達引起的pri-miR-22-3p/pri-miR-320a的下降，反之亦然(圖7W, X)。綜上所述研究表明THAP7-AS1/CUL4B復合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導的H3K27me3在轉錄水平抑制miR-22-3p/miR-320a的表達。

圖7 THAP7-AS1-CUL4B復合物可通過CUL4B催化的H2AK119ub1和EZH2介導的H3K27me3轉錄抑制miR-22-3p/miR-320a的表達

8、THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物

如圖8所示，THAP7-AS1高表達患者的LNM危險性更高，總體生存率更差，敲除THAP7-AS1后腫瘤大小和腫瘤下降，Ki67陽性率下降。提示THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物。

圖8 THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物

綜上所述，lncRNA在人GC組織中產(chǎn)生了差異表達譜。THAP7-AS1是一種新的促進GC進展的lncRNA，由SP1轉錄激活，并由METTL3介導的m6A修飾轉錄后穩(wěn)定。此外，THAP7-AS1促進了CUL4B與importin α1的結合，并增強了CUL4B蛋白進入細胞核的能力。THAP7-AS1/CUL4B復合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導的H3K27me3轉錄抑制miR-22-3p和miR-320a，從而激活PI3K/ AKT信號通路（圖8H）。本研究結果突出了GC中l(wèi)ncRNA、miRNA和蛋白之間重要的功能相互作用，提示THAP7-AS1可能成為GC治療的一個有前景的分子靶點。

參考文獻：

Liu Hai-Ting., Zou Yong-Xin., Zhu Wen-Jie., Sen-Liu., Zhang Guo-Hao., Ma Ran-Ran., Guo Xiang-Yu., Gao Peng.(2021). LncRNA THAP7-AS1, transcriptionally activated by SP1 and post-transcriptionally stabilized by METTL3-mediated m6A modification, exerts oncogenic properties by improving CUL4B entry into the nucleus. Cell Death Differ, undefined (undefined), undefined. Doi: 10.1038/s41418-021-00879-9