單細(xì)胞測(cè)序揭示了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄組譜

乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序，我們研究了來(lái)自15對(duì)原發(fā)腫瘤和腋窩淋巴結(jié)樣本的96796個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜。我們鑒定了9個(gè)癌細(xì)胞亞群，包括CD44+ / ALDH2 +/ALDH6A1+乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)。重要的是，BCSCs只存在于原發(fā)腫瘤中，并演化為浸潤(rùn)到淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移瘤。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示，NECTIN2-TIGIT介導(dǎo)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境(TME)細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)了免疫逃逸和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這項(xiàng)研究是第一次使用單細(xì)胞RNA測(cè)序描述乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄組譜。我們的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，并對(duì)開(kāi)發(fā)新的療法來(lái)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的起始有意義。本文于2021年10月發(fā)表于“Oncogenesis”（IF=7.485）。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）原發(fā)性乳腺癌和淋巴結(jié)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

我們從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的5例患者中，在治療性手術(shù)和腋窩淋巴結(jié)清除后立即獲得組織。這些組織樣本代表來(lái)自患者同側(cè)腋窩的成對(duì)原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)(圖1A)。為了獲得乳腺癌的全面轉(zhuǎn)錄組情況，我們對(duì)15個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。我們共獲得來(lái)自原發(fā)癌組織的27,028個(gè)單細(xì)胞和來(lái)自腋窩淋巴結(jié)的69,768個(gè)單細(xì)胞(圖1B)。我們將所有合格的細(xì)胞分為18種細(xì)胞類型(圖1B, C)。CD44 + / ALDH2 + /ALDH6A1 +組被定義為乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)。接著，我們分析樣品內(nèi)部組成(圖1D)。我們還采用反褶積分析對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中樣本的細(xì)胞組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示樣本中TNBC和非TNBC細(xì)胞的比例(圖1E)。該scRNA-seq數(shù)據(jù)具有TNBC細(xì)胞的特征，這些特征后來(lái)被用于定義TCGA樣本的分子亞型。

2）乳腺癌細(xì)胞的克隆分析

為了探索乳腺癌的基因組譜，我們應(yīng)用inferCNV算法分析單個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(CNVs)。我們發(fā)現(xiàn)，與其他癌細(xì)胞亞群相比，BCSCs突變較少(圖2A, B)。根據(jù)BCSCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)，選擇患者2進(jìn)行進(jìn)一步研究。5個(gè)CNV_cluster被分類，CNV_cluster 5與BCSC一致(圖2C)，隨后通過(guò)UMAP可視化證實(shí)了BCSC獨(dú)特的CNV特征，并將BCSC與其他惡性細(xì)胞分離(圖2D)。根據(jù)inferCNV分析，Heatmap顯示了5個(gè)CNV_簇的突變概況(圖2E)?；贑NV突變圖譜進(jìn)行進(jìn)化研究和軌跡分析，推斷乳腺癌的發(fā)展過(guò)程(圖2F, G)。BCSCs在軌跡過(guò)程的早期就被識(shí)別出來(lái)，并演化為兩個(gè)癌細(xì)胞分支(圖2F)。我們的CNV圖譜在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，CNV_cluster1和CNV_cluster4與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的突變最多。內(nèi)部組成揭示了腫瘤部位與進(jìn)化狀態(tài)的關(guān)系，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞處于晚期，而原發(fā)病變細(xì)胞較多，處于早期(圖2H, I)。RNA-velocity證實(shí)BCSC具有干性，并根據(jù)mRNA成熟度沿其演化軌跡進(jìn)行演化(圖2J)。

3）轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征

通過(guò)放大癌細(xì)胞，我們解剖了DEGs，分別鑒定了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞富集的功能和途徑。對(duì)于轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞，B2M、CD52、PTMA和GZMK是最顯著的DEGs，功能富集顯示了免疫治療的潛在敏感性，在轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞中免疫相關(guān)項(xiàng)目高度富集(圖3A)。對(duì)于轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞，CXCL14、STC2、CST3和RAMP3過(guò)表達(dá)(圖3B)。我們的轉(zhuǎn)錄組圖譜顯示了腫瘤位點(diǎn)和分子亞型之間的異質(zhì)性，Venn圖顯示了腫瘤間的相似性，在兩個(gè)TNBC和三個(gè)非TNBC樣本的轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)基因上調(diào)，而在兩個(gè)分子亞型中發(fā)現(xiàn)了103個(gè)基因下調(diào)(圖3C，D)。免疫熒光染色檢測(cè)淋巴結(jié)非TNBC細(xì)胞過(guò)表達(dá)基因(圖3F)。不同腫瘤位點(diǎn)和分子亞型的轉(zhuǎn)錄組差異揭示了乳腺癌腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，而一些發(fā)現(xiàn)與其他實(shí)體腫瘤的研究結(jié)果相呼應(yīng)，表明乳腺癌細(xì)胞的侵襲行為來(lái)源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

UMAP根據(jù)乳腺癌亞型、患者、樣本來(lái)源和細(xì)胞簇對(duì)所有合格的癌細(xì)胞進(jìn)行可視化(圖3E)。所有15個(gè)樣本的癌細(xì)胞被過(guò)濾后分為9個(gè)簇，其中C6具有BCSC生物標(biāo)志物，包括CD44和ALDH(圖3G)。我們發(fā)現(xiàn)，在TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，C7細(xì)胞最多，而在非TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，C3細(xì)胞占多數(shù)(圖3H)。參照C7的轉(zhuǎn)錄組圖譜，CCL5、PTPRC、CD2、CXCR4和SRGN的表達(dá)靠前。富集分析旨在更好地了解腫瘤細(xì)胞簇的生物學(xué)功能，展示其在合成、代謝、細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的生物活性(圖3I)。據(jù)我們所知，這是第一個(gè)基于整合單細(xì)胞RNA測(cè)序從轉(zhuǎn)錄組角度揭示轉(zhuǎn)移性乳腺癌差異的研究。

4）鑒別乳腺癌的惡性程序

我們應(yīng)用cNMF將腫瘤異質(zhì)性的完整轉(zhuǎn)錄組譜劃分為9個(gè)元程序，并根據(jù)這些元程序的特征基因?qū)γ總€(gè)腫瘤細(xì)胞簇進(jìn)行評(píng)分(圖4A-C)。每個(gè)元程序?qū)?yīng)一個(gè)具有內(nèi)在相似性或相關(guān)性的基因集，包括能量代謝(元程序1;CST3, CXCL14, COX6C)，癌癥相關(guān)信號(hào)通路(元程序3;GSTP1, EMP1, TIMP-1)，免疫激活和應(yīng)答(元程序5;LGALS3, PERP和EMP1)，淋巴細(xì)胞活化(元程序7; CXCR4、CD3D SRGN)，t細(xì)胞活化和DNA修復(fù)(元程序9;RICTOR、GZMK IFI16)。元程序可以更好地理解乳腺癌分子亞型和腫瘤部位的異質(zhì)性和相似性。C3在元程序 1中得分較高。根據(jù)功能富集(圖4D, E)，該元程序富集了物質(zhì)代謝和ERBB2信號(hào)通路。與轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞不同，該元程序分析表明，轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞在激活淋巴結(jié)的免疫識(shí)別中具有活性(圖4B、D和E)。元程序 7中富集的最重要功能包括淋巴細(xì)胞分化和激活，以及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。元程序9富集的主要功能包括t細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤中PD-L1表達(dá)和PD-1 checkpoint通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。

5）分析癌癥干細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊

為了證明TME中免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，我們使用UMAP可視化來(lái)自5個(gè)原發(fā)病灶和10對(duì)腋窩淋巴結(jié)的所有免疫細(xì)胞(圖5A，B)。TME在腫瘤部位的細(xì)胞組成和基因表達(dá)上都存在差異(圖5C，D)。與淋巴結(jié)內(nèi)的免疫細(xì)胞相比，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到原發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)的生物活性更強(qiáng)烈，并且在不同分子亞型的轉(zhuǎn)移中免疫反應(yīng)的功能差異顯著(圖5D，E)。基于多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具包(NATMI)分析，我們識(shí)別了不同樣品來(lái)源的細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通信(圖6A-F)。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的配體-受體對(duì)是淋巴結(jié)TME的重要組成部分。CD52-SIGLEC10和PTPRC-CD22參與了TNBC和非TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖6G, H)。基于淋巴結(jié)內(nèi)癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的DEGs和通信，我們的研究結(jié)果不僅解釋了乳腺癌細(xì)胞在不同部位的免疫逃逸機(jī)制，也為未來(lái)針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性過(guò)程的治療提供了靶點(diǎn)(圖6I)。通過(guò)與TIGIT相互作用，我們發(fā)現(xiàn)NECTIN2在轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)與TIGIT相互作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞抑制T細(xì)胞激活，抑制免疫應(yīng)答。我們進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色，證實(shí)了癌細(xì)胞與CD8+效應(yīng)T細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(圖6J)。

結(jié)論：我們描述了乳腺癌干細(xì)胞的特征，描述了腫瘤發(fā)生的進(jìn)化過(guò)程，確定了乳腺癌轉(zhuǎn)移特異性亞簇的轉(zhuǎn)錄組譜，并詳細(xì)地證明了腫瘤內(nèi)部和腫瘤間的異質(zhì)性。本研究為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步研究提供了新的思路，為乳腺癌患者的個(gè)體化治療奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Xu K, Wang R, Xie H, Hu L, Wang C, Xu J, Zhu C, Liu Y, Gao F, Li X, Wang C, Huang J, Zhou W, Zhou G, Shu Y, Guan X. Single-cell RNA sequencing reveals cell heterogeneity and transcriptome profile of breast cancer lymph node metastasis. Oncogenesis. 2021 Oct 5;10(10):66. doi: 10.1038/s41389-021-00355-6. PMID: 34611125; PMCID: PMC8492772.