自然殺傷細胞來源的外泌體miR-1249-3p可減輕2型糖尿病小鼠模型的胰島素抵抗和炎癥反應
2型糖尿病(T2D)是最常見的代謝性糖尿病，其特征是高血糖(也稱為高血糖)及胰島素抵抗。自然殺傷細胞(NK)被認為能通過調節(jié)全身炎癥進而影響T2D。然而，NK細胞調節(jié)胰島素敏感性的機制尚不清楚，本研究探討NK調控T2D的分子機制。本文于2021年10月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF= 12.818。
本文技術路線：
1、來自瘦小鼠的自然殺傷（NK）來源的外泌體可減輕肥胖誘導的胰島素抵抗
為探討NK來源外泌體在胰島素抵抗中的作用，采用高脂飼料(HFD)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立T2D小鼠模型，對照組飼喂正常鼠糧(NCD)。HFD小鼠體重顯著增加，空腹血糖(Fig 1a)、OGTT(Fig 1b)、ITT(Fig 1c)， HOMA-IR指數(shù)(Fig 1d)結果顯示， HFD小鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗。
通過流式細胞術從脾淋巴細胞中分離NK細胞，并用超離心法從NK細胞條件培養(yǎng)基中分離純化外泌體。電子顯微鏡(Fig 1e)和NanoSight分析(Fig 1f)顯示，從條件培養(yǎng)基中分離的NK細胞顆粒含有豐富的外泌體，其直徑為30 – 150nm。此外，作者從中檢出了HSP70，CD63、TSG101、CD9外泌體標志物，此外，內質網(wǎng)蛋白GRP94的缺失進一步證實分離的顆粒主要是外泌體(Fig 1g)。
為了確定NK來源外泌體的生物學功能，NCD小鼠和HFD小鼠分別通過NCD小鼠NCD來源性外泌體(NCD- exos)或HFD小鼠NK源性外泌體(HFD- exos)進行處理。NCD-Exos將HFD小鼠體重降至正常水平。空腹血糖、OGTT、ITT和HOMA-IR結果表明，NCD-Exos治療后HFD小鼠全身胰島素敏感性顯著提高(Fig. 1h–k)。然而，在其他組沒有顯著影響。因此，主要關注的是NCD-Exos和HFD小鼠的HFD- exos。為了觀察NK來源地外泌體在體內的分布情況，通過小鼠尾靜脈用紅色熒光PKH26染色的NCD-Exos處理小鼠。結果表明，NK來源的外泌體主要集中在內臟脂肪組織(VATs)、皮下脂肪組織(sat)、胰島和肝臟，而在肌肉組織(Fig. 1l)。此外，HFD小鼠體內肝甘油三酯水平和VAT的重量均顯著增加，但注射了NCD-Exos后，情況就大大緩解了(Fig. 1m, n).。此外，HFD小鼠在內臟脂肪組織和肝臟中注射NCD-Exos促炎因子基因表達明顯下調。
Fig 1 來自瘦小鼠的自然殺傷（NK）來源的外泌體可減輕肥胖誘導的胰島素抵抗
2. 脂肪少的NK來源的外泌體增強細胞胰島素敏感性
在NCD-Exos處理的3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中，p-Akt和PPARγ的表達增加，3T3-L1脂肪細胞中GLUT4表達也上調，然而，通過HFD-Exos處理則無明顯影響(Fig 2c-i)。
此外，NCD-Exos處理后，3 t3-l1脂肪細胞和AML12細胞中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α顯著下調 (Fig2j, k)。體外實驗結果結表明，NCD-Exos可提高脂肪細胞和肝細胞的胰島素敏感性，減輕炎癥反應，這與體內實驗結果一致。
Fig 2脂肪少的NK來源的外泌體增強細胞胰島素敏感性
3. NK來源的外泌體miR-1249-3p介導細胞胰島素敏感性和炎癥
越來越多的證據(jù)表明，大量的miRNAs被封裝在外泌體中，并在細胞-細胞通信中發(fā)揮重要作用。因此，作者假設NK來源的外泌體miRNA參與調節(jié)脂肪細胞和肝細胞的胰島素敏感性。為了識別所涉及的特定miRNA，作者首先進行了微陣列生成NCD-Exos和HFD-Exos的miRNA表達譜(Fig 3A)。通過單通道芯片計算差異表達miRNA的比較，發(fā)現(xiàn)1249-3p在NCD-Exos中增加最顯著（Fig 3B)）。GO和KEGG分析顯示miR-1249-3p直接參與代謝通路。此外，miR-1249-3p表達水平在NCD小鼠肝和肝中顯著升高。
接下來，為了驗證了外泌體miRNAs是否由NK細胞分泌并運輸?shù)桨屑毎?。轉染熒光cy3標記的擬態(tài)miR-1249-3p后，NK細胞與3T3-L1脂肪細胞或AML12細胞在Transwell TM平板中進行共培養(yǎng)(Fig 3c)。 Cy3染料在3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中的出現(xiàn)，表明擬態(tài)Cy3- mir -1249-3p能從Transwell TM上部的NK細胞傳遞到下部的受體脂肪細胞和肝細胞。Cy3染料伴在3T3-L1脂肪細胞以及AML12細胞中隨著miR-1249-3p豐度的增加而增加 (Fig 3c)。在對照實驗中，作者單獨使用Cy3染色(未與miR-1249-3p結合)處理NK細胞，再與3T3-L1脂肪細胞與AML12細胞共培養(yǎng)后并沒有檢測到Cy3染色。此外，NCD小鼠外泌體中miR-1249-3p的表達明顯高于NFD小鼠，這可能是由于外泌體通過循環(huán)系統(tǒng)從脾NK細胞遷移到靶細胞 (Fig 3b)?？傊?，外泌體miR-1249-3p可由NK細胞分泌，并被脂肪細胞和肝細胞攝取。
此外，還檢測了miR-1249-3p對胰島素功能的影響。將擬態(tài)MiR-1249-3p、抑制劑和陰性對照分別轉染至3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞，結果顯示，過表達MiR-1249-3p顯著增加了3T3-L1脂肪細胞胰島素刺激下的葡萄糖攝取(Fig 3d)，同時伴有促炎癥因子表達下調(Fig 3e)。在AML12細胞中，轉染擬態(tài)MiR-1249-3p促進胰島素對葡萄糖產(chǎn)生抑制作用(Fig 3f)，同時促炎因子表達降低(Fig3g)。綜上所述，上述結果提示NCD小鼠NK來源的外泌體miR-1249-3p可促進細胞胰島素敏感性，減輕炎癥反應。
Fig 3 NK來源的外泌體miR-1249-3p介導細胞胰島素敏感性和炎癥
4. 外泌體miR-1249-3p直接靶向SKOR1介導胰島素敏感性
為了確定外泌體miR-1249-3p的靶點，作者先使用了兩種生物信息學工具(miRDB和TargetScan)來預測，發(fā)現(xiàn)一組共同的靶點基因，并證實SKI家族轉錄共抑制因子1 (SKOR1)是miR-1249 - 3 - p的直接靶點 (Fig 4a)。在3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中，SKOR1蛋白表達被miR-1249-3p下調 (Fig 4b)。然而，SKOR1 mRNA水平基本沒有變化。隨后，miR-1249-3p與SKOR1全長之間的序列比對顯示SKOR1的3'UTR可能是miR-1249-3p的潛在靶點(Fig 4c)。然后將野生型和突變的miR- 1249-3p結合位點克隆到熒光素酶載體中。發(fā)現(xiàn)與野生型結合位點載體共轉染miR-1249-3p的3T3-L1脂肪細胞中，熒光素酶活性顯著降低。然而，含有突變結合位點載體的細胞沒有表現(xiàn)出這種抑制(Fig 4d)。 此外， 在HFD小鼠的內臟脂肪組織和肝臟中，NCD-Exos能降低了SKOR1蛋白的表達(Fig. 4e)。這些結果表明SKOR1是脂肪細胞和肝細胞中miR-1249-3p的直接靶點。
此外，作者發(fā)現(xiàn)，敲低SKOR1增加了3T3-L1脂肪細胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取，并促進了胰島素對AML12細胞中葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用，同時兩個細胞中的促炎因子減少(Fig 4f-i)，這被miR-1249- 3 p抑制劑中和(Fig. 4j–q)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SKOR1是miR-1249-3p的直接下游靶點，并介導葡萄糖穩(wěn)態(tài)。
Fig4外泌體miR-1249-3p直接靶向SKOR1介導胰島素敏感性
作者通過蛋白互作預測工具評估SKOR1與蛋白的相互作用，并找到了LBX1和SMAD 6 (Fig 5a)。進一步探索SKOR1和SMAD6之間的關系。由于SKOR1沒有改變 3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中SMAD6的表達(Fig. 5b–d), 于是假設SKOR1可能通過TLR4/NF-κB通路與SMAD6相互作用調節(jié)炎癥反應。通過免疫沉淀反應發(fā)現(xiàn)SKOR1-IP細胞裂解液中檢測到SMAD6 (Fig. 5e)。然后，SMAD6-IP抗體細胞裂解液中檢測到檢測SKOR1SMAD6-IP片段(Fig5e)?？偟膩碚f，這些結果表明SKOR1在脂肪細胞和肝細胞中與SMAD6相互作用。
Fig 5 SKOR1在脂肪細胞和肝細胞中與SMAD6相互作用
6. MiR-1249-3p通過SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸調節(jié)炎癥反應和胰島素抵抗
以上結果表明，miR-1249-3p抑制3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的表達，SKOR1是miR-1249-3p的直接靶點，SKOR1與SMAD6相互作用。之前的研究已經(jīng)闡明SMAD6與SMURF1結合以及MyD88形成SMAD6/ MyD88/SMURF1三元復合物，進而抑制TLR4信號轉導的證據(jù)；TLR4與相應配體結合，進一步激活NF-κB，從而促進a中多種炎癥因子的上調。因此，作者猜想miR-1249-3p/SKOR1軸在TLR4/NF-κ b依賴的促炎信號通路中起重要作用。
首先，作者轉染了擬態(tài)miR-1249-3p或siRNA -SKOR1到 3T3-L1脂肪細胞和AML12細胞中(Fig 6a, b)。免疫印跡分析及ELISA分析(Fig 6d-f)顯示轉染擬態(tài)miR-1249-3p或敲低SKOR1顯著抑制p65磷酸化，進而下調促炎基因IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明，miR-1249-3p/SKOR1軸通過介導NF-κB信號通路抑制促炎基因表達。SMAD6沉默時，miR-1249-3p對TLR4/NF-κB軸活化的抑制作用得到緩解，但未完全阻斷(Fig. 6c, g, h)，提示SMAD6在miR-1249-3p介導的胰島素抵抗和炎癥減弱中起重要作用，在此過程中可能存在其他信號通路?？傊?，這些結果表明，NK來源的外泌體miR-1249-3p通過SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸緩解胰島素抵抗和炎癥(Fig 6i)。
Fig 6 MiR-1249-3p通過SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸調節(jié)炎癥反應和胰島素抵抗
綜上所述，本研究揭示了nk來源的外泌體miR-1249-3p通SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸減輕胰島素抵抗和炎癥反應，并在T2D中提供一系列潛在的治療靶點。進一步研究miR-1249-3p和SKOR1阻滯劑在T2D小鼠中的治療效果和臨床試驗。
參考文獻：
Wang, Y., et al., Natural killer cell-derived exosomal miR-1249-3p attenuates insulin resistance and inflammation in mouse models of type 2 diabetes. Signal Transduct Target Ther, 2021. 6(1): p. 409.