RNA N6甲基腺苷讀取器IGF2BP2以m6A依賴的方式穩(wěn)定slug mRNA促進頭頸鱗癌細胞的淋巴轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗癌（HNSCC）患者預(yù)后不良的主要原因。N6甲基腺苷（m6A）RNA修飾是一種新興的基因表達表觀遺傳調(diào)控機制，IGF2BP2作為一種新的m6A讀取器蛋白參與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。然而，目前對IGF2BP2在中的功能作用知之甚少，IGF2BP2是否通過m6A修飾在HNSCC中調(diào)節(jié)淋巴轉(zhuǎn)移仍有待確定。目前，有相關(guān)研究于2022年1月發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF: 11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達及臨床意義

為了研究m6A修飾在HNSCC中的作用，從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了502個HNSCC和44個正常組織中20個m6A相關(guān)調(diào)控因子的表達譜。如圖1A和B所示，與正常組織相比，HNSCC組織中20個m6A調(diào)控基因中有18個顯著上調(diào)，包括6個writers（VIRMA、ZC3H13、METTL14、METTL3、WTAP和RBM15）、2個erasers（FTO和ALKBH5）和10個readers（IGF2BP2、IGF2BP1、IGF2BP3、YTHDF3、YTHDF2、YTHDC1、YTHDF1、HNRNPC、RBMX和HNRNPA2B1）。HNSCC組織和正常組織中YTHDC2和RBM15B的表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異。臨床相關(guān)性中，只有IGF2BP2的高表達與HNSCC患者較低的生存概率相關(guān)（圖1C）。Kaplan-Meier生存分析、多變量cox回歸分析后和病理N分期均表示IGF2BP2被確定為HNSCC中潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖1C-1G）。

圖1 m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達及臨床意義

2.   IGF2BP2在HNSCC組織中的高表達與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)

臨床組織樣本中q-PCR和western blot均表示IGF2BP2在HNSCC腫瘤樣本中過表達（圖2A,2B）。通過臨床病理特征和隨訪數(shù)據(jù)，IGF2BP2在NATs中表達量較低，在未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達量略有升高，但在有淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達量強烈上調(diào)（圖2E,2F），且IGF2BP2高表達與較低的OS概率相關(guān)（圖2G）。此外，臨床病理特征分析顯示，IGF2BP2表達與病理N分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（表1）。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，IGF2BP2表達是HNSCC患者的獨立預(yù)后因素（表2）?？傊@些結(jié)果表明，在HNSCC中IGF2BP2高表達，并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

圖2 IGF2BP2在HNSCC組織中高表達，與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)

3.   IGF2BP2在體外促進HNSCC細胞的轉(zhuǎn)移行為

為了明確IGF2BP2是否能誘導(dǎo)HNSCC細胞的遷移和侵襲能力，對IGF2BP3進行敲降和過表達。通過RT-qPCR和western blot驗證了敲除和過表達的有效性（圖3A,3B）。創(chuàng)傷愈合分析表明，IGF2BP2的敲除抑制了FaDu和SCC15細胞的遷移能力，而過表達IGF2BP2后則出現(xiàn)相反的結(jié)果（圖3C,3D）。Transwell分析進一步證實了這一結(jié)果，顯示沉默IGF2BP2可減弱FaDu和SCC15細胞的遷移性和侵襲性，而過表達IGF2BP2則增強了細胞的轉(zhuǎn)移?？傊@些數(shù)據(jù)表明IGF2BP2促進HNSCC細胞的遷移和侵襲。

圖3 IGF2BP2促進體外HNSCC細胞轉(zhuǎn)移行為

4.  在體內(nèi)，IGF2BP2基因敲除可抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成

為了進一步確定IGF2BP2在HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，使用裸鼠建立腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型（圖4A）。RT-qPCR和western blot驗證IGF2BP2的沉默效率（圖4B,4C），然后將這些細胞注射插入裸鼠中。4周后，通過體內(nèi)生物發(fā)光成像檢測IGF2BP2對淋巴轉(zhuǎn)移的影響。IGF2BP2基因敲除顯著抑制了HNSCC細胞的淋巴轉(zhuǎn)移（圖4D）。此外，sh-IGF2BP2組的腳掌腫瘤和腘窩淋巴結(jié)均比sh-NC組小、輕，提示IGF2BP2抑制了HNSCC的腫瘤發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移（圖4E-J）。此外，sh-IGF2BP2組的LN轉(zhuǎn)移率低于sh-NC組（圖4K）。免疫組化分析顯示，沉默IGF2BP2顯著降低了小鼠組織瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的微淋巴管密度水平，這由lyve1陽性微血管表明（圖4L）。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)，IGF2BP2基因敲除顯著抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

圖4體內(nèi)IGF2BP2基因敲除抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成

5.   IGF2BP2調(diào)控HNSCC細胞的EMT程序

為了分析IGF2BP2在調(diào)節(jié)EMT中的作用，用TGF-β處理FaDu和SCC15細胞。72小時后，觀察到細胞-細胞接觸減少，梭形形態(tài)為間充質(zhì)細胞（圖5A）。此外，免疫熒光染色和共聚焦成像分析顯示，經(jīng)TGF-β處理的FaDu和SCC15細胞形成了廣泛的絲狀足和板狀足，如白色箭頭所示，使細胞獲得了遷移和侵襲能力（圖5B）。此外，western blot分析顯示，TGF-β誘導(dǎo)兩種HNSCC細胞E-Cadherin表達減少，這被認為是EMT轉(zhuǎn)移的標(biāo)志（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)TGF-β處理的HNSCC細胞系處于EMT過程中。

RT-qPCR和western blot分析顯示，在經(jīng)TGF-β處理的FaDu和SCC15細胞中，IGF2BP2缺失可下調(diào)N-Cadherin和vimentin的表達水平，而E- cadherin在mRNA和蛋白水平上上調(diào)（圖5D-E）。免疫熒光染色和共聚焦成像分析進一步證實，沉默IGF2BP2導(dǎo)致波形蛋白表達的丟失，同時在兩種HNSCC細胞的細胞表面E-Cadherin的保留，這表明IGF2BP2可能調(diào)節(jié)EMT程序（圖5F）。為了進一步證實IGF2BP2在EMT中的作用，在沒有TGF-β處理的情況下，用IGF2BP2和相應(yīng)的對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)FaDu和SCC15細胞，檢測了EMT相關(guān)標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)E-Cadherin確實下調(diào)了，而N-Cadherin和vimentin在mRNA和蛋白水平均上調(diào)（圖5G-H）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2在調(diào)節(jié)HNSCC細胞的EMT程序中具有重要的功能。

圖5 IGF2BP2調(diào)控HNSCC細胞EMT程序

6.   在HNSCC細胞中，Slug參與IGF2BP2調(diào)控的EMT

在HNSCC的TCGA數(shù)據(jù)庫中，spearman相關(guān)分析顯示，與Snail、ZEB1和Twist相比，在502份HNSCC組織樣本中，Slug和IGF2BP2之間的正相關(guān)性最強，表明在HNSCC中IGF2BP2和Slug之間可能存在正調(diào)控機制(圖6A)。此外，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫，從IGF2BP2^high表達的HNSCC組織到IGF2BP2^low表達的HNSCC組織，再到正常的鄰近組織，均觀察到Slug的表達水平顯著降低(圖6B)。RT-qPCR和western blot分析顯示，抑制IGF2BP2顯著降低了FaDu和SCC15細胞中mRNA和蛋白水平的Slug表達，而過表達IGF2BP2顯著增強了Slug的表達(圖6C-F)。同時，在FaDu和SCC15細胞中，Snail、ZEB1和Twist的mRNA水平無顯著或一致的變化(圖6C)。western blot分析結(jié)果顯示，在FaDu細胞中，敲除Slug可拮抗過表達IGF2BP2誘導(dǎo)的波形蛋白上調(diào)和E-Cadherin下調(diào)(圖6G)。相反，在FaDu細胞中，IGF2BP2過表達部分逆轉(zhuǎn)了由Slug抑制引起的波形蛋白下調(diào)和E-Cadherin上調(diào)(圖6G)。此外，創(chuàng)傷愈合實驗表明，沉默Slug可減弱FaDu細胞中IGF2BP2過表達對細胞遷移的促進作用(圖6H)。另外，IGF2BP2高表達標(biāo)本表現(xiàn)為高Slug表達，而IGF2BP2低表達標(biāo)本表現(xiàn)為低至中等Slug表達(圖6I)。根據(jù)免疫組化定量評分，IGF2BP2與Slug表達呈穩(wěn)健的正相關(guān)(r =0.752, p-value < 0.001)(圖6 j)。這些發(fā)現(xiàn)表明，Slug在IGF2BP2調(diào)控的HNSCC EMT中具有關(guān)鍵作用。

圖6 Slug參與了HNSCC細胞中IGF2BP2調(diào)節(jié)的EMT

7.   IGF2BP2通過修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性

使用抗IGF2BP2抗體在FaDu和SCC15細胞中進行了RIP-qPCR檢測，結(jié)果顯示與IgG對照組相比，Slug mRNA顯著富集，證實了IGF2BP2和Slug mRNA之間的相互作用(圖7A)。為了驗證Slug是否受m6A修飾的影響，從而導(dǎo)致IGF2BP2識別甲基化Slug，我們進行了MeRIP qPCR分析，并確定與相應(yīng)的對照細胞相比，IGF2BP2的敲除顯著降低了FaDu和SCC15細胞中Slug的m6A水平（圖7B）?；?/span>SRAMP軟件分析，在Slug mRNA的CDS區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個非?？尚诺?/span>m6A位點(圖7C)。為了驗證假設(shè)的m6A位點，使用含有野生型(WT) Slug-CDS或突變型(MT) Slug-CDS序列的熒光素酶報告基因進行了檢測(圖7D)。如預(yù)期的那樣，當(dāng)IGF2BP2沉默時，SlugWT的熒光素酶活性顯著減弱，而Slug-MT的熒光素酶活性似乎不受影響(圖7E)。此外，mRNA穩(wěn)定性分析顯示，在FaDu和SCC15細胞中，IGF2BP2沉默后，Slug mRNA的表達量降低，且Slug mRNA的半衰期持續(xù)縮短(圖7F)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2以m6A修飾依賴的方式直接將CDS區(qū)與Slug mRNA結(jié)合并穩(wěn)定其mRNA。

圖7 IGF2BP2通過修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性

結(jié)論：

綜上所述，該研究首次揭示了IGF2BP2在促進HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床和生物學(xué)功能，并證明IGF2BP2通過穩(wěn)定Slug mRNA，以m6A依賴的方式促進EMT和細胞轉(zhuǎn)移（圖7G）。這些結(jié)果表明，IGF2BP2可以作為LN轉(zhuǎn)移的預(yù)測生物標(biāo)志物，也是HNSCC患者抗轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點。

參考文獻：

Yu D, Pan M, Li Y, Lu T, Wang Z, Liu C, Hu G. RNA N6-methyladenosine reader IGF2BP2 promotes lymphatic metastasis and epithelial-mesenchymal transition of head and neck squamous carcinoma cells via stabilizing slug mRNA in an m6A-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):6.