CircIL4R通過miR-761/TRIM29/PHLPP1軸激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移

越來越多的研究表明，circrna (circRNAs)的異常表達(dá)廣泛參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括結(jié)直腸癌(CRC)。然而，新型circRNA在CRC中的臨床意義、水平、特征、生物學(xué)功能和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究探討CircIL4R在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，于2022年11月發(fā)表于《Molecular cancer》，IF=15.302。

本文技術(shù)路線： 

1. CircIL4R在CRC細(xì)胞中被識別
   識別新的致癌circrna有助于了解CRC進(jìn)展，作者基于公開可用的GEO數(shù)據(jù)集(GSE126094)進(jìn)行了生物信息分析，該數(shù)據(jù)集包括10對CRC組織和ANTs。分析結(jié)果顯示共有59個明顯異常的circrna，其中 23個circrna表達(dá)上調(diào)，36個circrna表達(dá)下調(diào)(Fig. 1a)。為了進(jìn)一步驗證這些在CRC細(xì)胞株中的表達(dá)模式，作者選擇了14個候選circrna。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與FHC細(xì)胞比較，新circRNA hsa_circ_0038718在HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29和SW480 CRC細(xì)胞中顯著上調(diào)；因此，作者將這個circrna作為進(jìn)一步研究的重點(Fig. 1B)。接下來，基于circBase數(shù)據(jù)庫的注釋，研究hsa_circ_0038718的結(jié)構(gòu)。序列分析表明，hsa_circ_0038718是由IL4R基因的第3、4外顯子(Chr16: 27，351，506-27，353，580)，長度為227nt；因此，作者在本研究中將其命名為circIL4R(Fig. 1C)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，circIL4R僅在cDNA中有擴(kuò)增，在gDNA中無擴(kuò)增，證實了CRC中circIL4R呈環(huán)形(Fig. 1d)。此外，RNase R酶切檢測結(jié)果顯示，circIL4R mRNA對RNase具有抗性，而線性IL4R mRNA則對R治療不具有抗性(Fig. 1e)。同樣，放線菌素D RNA穩(wěn)定性分析表明，circIL4R的半衰期比線性IL4R的半衰期更長(Fig. 1f)。隨后，通過核-細(xì)胞質(zhì)分離和FISH檢測circIL4R的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，circIL4R主要定位于CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(Fig. 1g， h)?？傊?，位于細(xì)胞質(zhì)中的circIL4R在CRC中是一種高度穩(wěn)定且經(jīng)常上調(diào)的circRNA。

Fig1 CRC細(xì)胞中circIL4R的鑒定

2.circIL4R在CRC患者中的表達(dá)及其臨床意義

為了確定circIL4R在CRC患者中的臨床意義，作者首先在一個隊列中驗證了circIL4R表達(dá)情況。FISH染色和qRT-PCR結(jié)果檢測顯示，與ANTs組織相比，CRC組織中circIL4R明顯上調(diào)，與GEO數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析結(jié)果一致(Fig. 2a-d)。鑒于circrna高度穩(wěn)定且不易降解，作者進(jìn)一步探索circIL4R是否可以用作CRC的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。作者首先在一組50例CRC患者中檢測了circIL4R術(shù)前和術(shù)后的血清水平。結(jié)果顯示，術(shù)后標(biāo)本中血清circIL4R較術(shù)前標(biāo)本減少(Fig. 2e)。接下來，作者在另一組40例CRC患者和40例健康受試者中評估了circIL4R的血清表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRC患者的血清circIL4R明顯高于健康受試者(Fig. 2f)。ROC曲線顯示表明circIL4R標(biāo)志物具有良好的CRC診斷價值Fig. 2g)。在此外circIL4R的表達(dá)在腫瘤病理分期、T分型、N分型和M分型組中存在差異Fig. 2h-k)。對120例CRC患者生存隨訪資料進(jìn)行分析。Kaplan-Meier生存曲線顯示circIL4R過表達(dá)與預(yù)后差呈正相關(guān)(Fig. 2l，m)?？傊?，這些結(jié)果提示circIL4R可作為CRC的一種有效的預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶點。

3.     TFAP2C在CRC中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控誘導(dǎo)circIL4R的表達(dá)

通過JASPAR數(shù)據(jù)庫識別IL4R啟動子區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄因子，TFAP2C因其位于IL4R啟動子區(qū)域的兩個高親和力響應(yīng)元件而受到關(guān)注，分別命名為TBS1和TBS2(Fig. 3a)。此外，GEPIA數(shù)據(jù)庫的相關(guān)分析顯示TFAP2C與IL4R呈正相關(guān)(Fig. 3b)。然后，作者構(gòu)建了TFAP2C過表達(dá)和干擾質(zhì)粒，通過qRT-PCR和WB驗證TFAP2C在CRC細(xì)胞中的相對表達(dá)(Fig. 3c， d)。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，在TFAP2C基因敲除后，?1987/?913片段驅(qū)動的熒光素酶活性顯著降低(Fig. 3h)，而在TFAP2C過表達(dá)的細(xì)胞中增強(qiáng)(Fig. 3i)。然而，?792/429片段的變化對TFAP2C表達(dá)的變化及熒光素酶的活性沒有影響(Fig. 3h,i)。這些結(jié)果證實了TFAP2C反應(yīng)位點包含在IL4R啟動子?1987/?913區(qū)域。接下來，針對IL4R啟動子的不同區(qū)域設(shè)計7對引物(P1-7) (Fig. 3j)。ChIP和定量PCR結(jié)果顯示TFAP2C與P5-7區(qū)域結(jié)合。值得注意的是，P5和P6也被稱為IL4R啟動子中的TFAP2C結(jié)合位點1 (TBS1)和TBS2(圖3k)。此外，作者在120人的隊列中通過qRT-PCR驗證了TFAP2C的mRNA表達(dá)，應(yīng)用免疫組化法檢測TMAs中TFAP2C蛋白水平。結(jié)果顯示，與ANTs相比，TFAP2C在CRC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并與circIL4R呈正相關(guān)(Fig. 3l-n)。

Fig 3 TFAP2C通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)circIL4R的表達(dá)

4.     CircIL4R在體外促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
   為了研究circIL4R在CRC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，作者構(gòu)建了兩個siRNA(si-circIL4R#1和sicircIL4R#)，采用qRT-PCR方法檢測circIL4R在不同CRC細(xì)胞系(HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29、SW480)和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞株(FHC)中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，circIL4R在HCT116和DLD1細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，在LoVo細(xì)胞中表達(dá)相對較低。接下來在HCT116和DLD1細(xì)胞來敲除circIL4R，在LoVo細(xì)胞中過表達(dá)circIL4R，發(fā)現(xiàn)對IL – 4R mRNA水平均無影響(Fig. 4a,b)。CCK-8、EdU和集落形成實驗表明，下調(diào)circIL4R可顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)circIL4R則相反(Fig. 4c-h）。這些結(jié)果清楚地表明，circIL4R促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖。采用Transwell和創(chuàng)面愈合試驗檢測circIL4R對CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示，下調(diào)circIL4R表達(dá)顯著抑制了HCT116和DLD1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。相反，過表達(dá)circIL4R顯著增強(qiáng)了LoVo細(xì)胞的這些能力(Fig. 4i-l）?？傊?，這些結(jié)果表明circIL4R在體外促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

Fig 4體外circIL4R促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

5.CircIL4R通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲行為

KEGG分析結(jié)果顯示，circIL4R與PI3K-Akt信號通路顯著相關(guān)(Fig. 5a)，因此，作者推斷circIL4R通過PI3K / AKT信號通路促進(jìn)CRC發(fā)展。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HCT116和HCT116中，下調(diào)circIL4R基因的表達(dá)，顯著降低了p-AKT及其下游相關(guān)基因的表達(dá)水平，PI3K和AKT的總蛋白水平似乎穩(wěn)定(Fig. 5b)。此外，下調(diào)circIL4R對HCT116增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用。740YP（PI3K / AKT信號通路的活化劑）的存在明顯減輕了DLD1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而LY294002（PI3K/AKT信號通路的抑制劑）對過表達(dá)circIL4R對LoVo細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的刺激作用明顯減弱(Fig. 5b)。此外，下調(diào)circIL4R對HCT116增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用，在740YP作用下過表達(dá)circIL4R對LoVo細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的刺激作用明顯減弱(Fig. 5c-j)。綜上所示，circIL4R通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

Fig 5 circIL4R激活PI3K/AKT信號通路

6.     CircIL4R在CRC細(xì)胞中充當(dāng)miR - 761的海綿
   通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測到有7個miRNAs (miR-513a-5p， miR-1286， miR-761， miR-3619-5p， miR-214-3p， miR-1184， miR-139-3p)是circIL4R的潛在靶點(Fig. 6a，b)。通過RNA pull-down檢測進(jìn)一步確認(rèn)circIL4R的結(jié)合位點，并通過qRT -PCR驗證生物素標(biāo)記的circIL4R探針(Fig. 6c)。結(jié)果表明，在HCT116和DLD1細(xì)胞系中，miR-761顯著富集(Fig. 6d,e)。為了闡明circIL4R和miR-761之間的相互作用，作者構(gòu)建了一個包含野生型(WT)或突變型(Mut)序列的熒光素酶報告基因(Fig. 6f)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-761模擬物顯著抑制了表達(dá)circIL4R的細(xì)胞中的熒光素酶活性，而circIL4R Mut報告組細(xì)胞表達(dá)量無顯著差異(Fig. 6g, h)。然后，作者研究了miR-761在120名CRC患者和CRC細(xì)胞系中的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-761在CRC組織中顯著下調(diào)，且與circIL4R呈負(fù)相關(guān)(Fig. 6j-l)。此外，miR-761在CRC細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)(Fig. 6i)。此外，FISH檢測結(jié)果顯示，circIL4R和miR-761在CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖6m)?？傊?，circIL4R可能在CRC細(xì)胞中作為miR-761的海綿。

Fig 6 circIL4R在CRC細(xì)胞中作為miR-761的海綿

7. TRIM29是miR - 761的下游靶基因

基于四個數(shù)據(jù)庫的交叉分析發(fā)現(xiàn)了miR-761靶向的64個候選基因(Fig. 7a)。接下來，作者評估了這些候選基因在結(jié)腸癌和直腸癌組織中的表達(dá)。在miR-761的預(yù)測靶基因中，TRIM29成為作者的主要研究重點，因為與正常組織相比，它在CRC樣本中顯著上調(diào)(Fig. 7b， c)。GEO數(shù)據(jù)庫(GSE87211)得到相同的結(jié)果(Fig. 7d)。隨后，qRT-PCR檢測和WB結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-761模擬物顯著降低了CRC細(xì)胞中TRIM29 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-761抑制劑則引起相反的結(jié)果(Fig. 7e, f)。為了進(jìn)一步闡明miR-761和TRIM29之間的相互作用，作者構(gòu)建了包含WT或Mut TRIM29 3 ' -UTR的熒光素酶報告基因 (Fig 7g). 熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎D(zhuǎn)染miR-761模擬物顯著抑制了表達(dá)TRIM29 WT報告基因的細(xì)胞的熒光素酶活性，而在表達(dá)TRIM29-MUT的細(xì)胞中未檢測到顯著差異 (Fig. 7h，i)，表明miR-761通過直接結(jié)合到3' -UTR的TRIM29降低TRIM29的表達(dá)。臨床相關(guān)結(jié)果顯示，在120個CRC組織隊列中，TRIM29 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，并與miR-761水平呈負(fù)相關(guān)，與circIL4R水平呈正相關(guān)(Fig. 7j-m)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明TRIM29是miR-761的直接靶點。

Fig 7 TRIM29是miR-761的下游靶點

8. CircIL4R通過miR - 761/TRIM29軸激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)CRC進(jìn)展

TRIM29作為miR-761的下游靶點，已被證實為CRC中的癌基因。因此，作者進(jìn)一步研究circIL4R和TRIM29的功能。首先，CRC細(xì)胞中干擾或過表達(dá)TRIM29。CCK-8、集落形成、Transwell和創(chuàng)面愈合實驗證實過表達(dá)TRIM29促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而敲低TRIM29則表現(xiàn)出相反的效果(Fig. 8a-d)。更重要的是，作者觀察到過表達(dá)TRIM29可以抑制circIL4R敲除引起的HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制，而敲除TRIM29可以在很大程度上抑制circIL4R過表達(dá)引起的LoVo細(xì)胞的惡性進(jìn)展(Fig. 8a-d)。作者進(jìn)一步研究了circIL4R是否通過miR-761/TRIM29軸激活PI3K/AKT信號通路。WB檢測結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，circIL4基因下調(diào)導(dǎo)致的p-AKT水平降低可以被TRIM29的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)(Fig. 8e)。 相反，過表達(dá)circIL4R誘導(dǎo)的p-AKT水平的上調(diào)可以通過下調(diào)TRIM29來抑制(Fig. 8e)。綜上所述，circIL4R在促進(jìn)PI3K/AKT信號通路激活和調(diào)控CRC惡性進(jìn)展中的作用在很大程度上依賴于miR-761/TRIM29軸。

已知腫瘤抑制因子PTEN、PP2A和PHLPP1可抑制PI3K/AKT通路的活性。然而抑制或過表達(dá)TRIM29均不改變PTEN和PP2A的表達(dá)(Fig. 8f)。TRIM29敲低可上調(diào)PHLPP1的蛋白表達(dá)，過表達(dá)TRIM29則相反；對PHLPP1 mRNA水平無顯著影響(Fig. 8f,g)。 WB分析顯示，TRIM29基因敲除可抑制p-AKT水平。si-TRIM29和si-PHLPP1共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)，反之亦然(Fig. 8h)。作者推測TRIM29也可以過泛素化修飾PHLPP1激活PI3K/AKT途徑通。為了證實這一假設(shè)，作者首先用抗TRIM29和抗PHLPP1抗體進(jìn)行了共免疫沉淀試驗，以檢測TRIM29是否與PHLPP1相互作用。結(jié)果驗證了內(nèi)源性TRIM29和PHLPP1蛋白在HCT116細(xì)胞中的相互作用(Fig. 8i)，在過表達(dá)TRIM29的HCT116細(xì)胞中，PHLPP1的半衰期明顯降低(Fig. 8j)，提示TRIM29可以介導(dǎo)PHLPP1蛋白的降解。此外，TRIM29對PHLPP1的調(diào)控可被蛋白酶體抑制劑MG132調(diào)控(Fig. 8k)， 這進(jìn)一步說明其調(diào)控可能源于泛素化過程。更重要的是，泛素化實驗顯示，在HCT116細(xì)胞中，TRIM29敲除后PHLPP1泛素化減少，而TRIM29過表達(dá)則導(dǎo)致相反的效果(Fig. 8l)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明circIL4R可能激活PI3K/AKT信號通路通過trim29介導(dǎo)的泛素化和隨后的PHLPP1降解。

Fig 8 circIL4R通過circIL4R/miR-761/TRIM29/PHLPP1軸促進(jìn)CRC進(jìn)展

9. CircIL4R在體內(nèi)促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步驗證circIL4R在體內(nèi)對CRC細(xì)胞增殖的影響，在HCT116和DLD1細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circIL4R 敲低(sh-circIL4R)或陰性對照(sh-Ctrl)（Fig. 9a），然后通過慢病毒包裝注入BALB/c裸鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，下調(diào)circIL4R顯著抑制了兩種HCT116和DLD1細(xì)胞的腫瘤生長(Fig. 9b,c)。此外，與對照組相比，sh- circil4r組腫瘤的體積和重量明顯減少(Fig. 9d,e)。免疫組化染色顯示，下調(diào)circIL4R可降低Ki-67、TRIM29和p-AKT的表達(dá)水平，提高PHLPP1的表達(dá)水平(Fig. 9f)。此外，將熒光素標(biāo)記的CRC細(xì)胞注射到裸小鼠尾靜脈，以確定circIL4R是否能在體內(nèi)促進(jìn)CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Fig. 9g)。結(jié)果顯示，circIL4R基因敲除顯著降低了小鼠肺部的熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量(Fig. 9h-j)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，與陰性對照組相比，circIL4R敲除組裸鼠的總生存期更長(Fig. 9k,l)。這些結(jié)果與體外實驗一致，證實了circIL4R在體內(nèi)可促進(jìn)CRC的惡性進(jìn)展。

Fig 9 circIL4R在體內(nèi)促進(jìn)CRC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移

本研究首次證明circIL4R在CRC細(xì)胞、組織和血清中的表達(dá)顯著增加，并可作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外，TFAP2C通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控誘導(dǎo)circIL4R表達(dá)，且circIL4R過表達(dá)與miR-761競爭性相互作用，增強(qiáng)TRIM29的表達(dá)，從而靶向PHLPP1進(jìn)行泛素介導(dǎo)的降解，激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)CRC的進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

Jiang, T., et al., CircIL4R activates the PI3K/AKT signaling pathway via the miR-761/TRIM29/PHLPP1 axis and promotes proliferation and metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer, 2021. 20(1): p. 167.