lncRNA TINCR促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展，抑制對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性

lncRNA在肝細(xì)胞癌(HCC)的進(jìn)展和化療耐藥性中起重要作用。深入研究其具體的調(diào)控機(jī)制對(duì)于提供潛在的治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。本研究旨在探討lncRNA TINCR在HCC進(jìn)展和奧沙利鉑反應(yīng)中的調(diào)控作用及機(jī)制。我們的發(fā)現(xiàn)提示，存在一個(gè)TINCR/miR-195-3p/ST6GAL1/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸調(diào)控腫瘤進(jìn)展和奧沙利鉑耐藥，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸可能用于肝癌的抗腫瘤治療。本文于2022年1月發(fā)表于雜志“JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH”（IF=11.161）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）TINCR在HCC中上調(diào)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)

為了識(shí)別調(diào)控HCC進(jìn)展的lncRNAs，我們對(duì)5例HCC患者的5對(duì)腫瘤和正常組織進(jìn)行了完整的轉(zhuǎn)錄組序列。共發(fā)現(xiàn)49個(gè)不同表達(dá)的lncRNA (圖1A)，其中TINCR是HCC中顯著上調(diào)的lncRNA之一。此外，我們通過(guò)qRT-PCR再次證實(shí)，與50個(gè)正常組織相比，50個(gè)HCC組織中TINCR的表達(dá)顯著升高(圖1B-C)。我們利用qRT-PCR進(jìn)一步研究了TINCR對(duì)139例HCC冷凍HCC組織的預(yù)后價(jià)值。根據(jù)TINCR表達(dá)中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果顯示，TINCR高組患者的總生存期(圖1D-E)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(圖1F)較差。生存圖顯示三組患者的總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率有顯著的分層(圖1G-H)。

2）TINCR促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和對(duì)奧沙利鉑的耐藥性

我們?cè)?/span>HuH7和HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了si-TINCR (si-TINCR 1#和si-TINCR 2#)和TINCR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1TINCR)，并采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率(圖2A-B)。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-TINCR的HCC細(xì)胞的增殖受到顯著抑制(圖2C和E)。同樣，pcDNA3.1-TINCR轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞與空載體轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞效果相反(圖2D和F)。沉默TINCR可抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲(圖2G)，而過(guò)表達(dá)TINCR可增強(qiáng)這些細(xì)胞行為(圖2H)。此外，我們研究了TINCR在奧沙利鉑敏感性調(diào)節(jié)中的作用。在不同濃度梯度的奧沙利鉑下，CCK-8和凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默TINCR可顯著提高肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性(圖3A-D)。在過(guò)表達(dá)的HCC細(xì)胞中證實(shí)了相反的效果(圖3E-H)。這些結(jié)果表明，在HCC中，TINCR作為一種促癌lncRNA促進(jìn)增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)對(duì)奧沙利鉑的敏感性。

3）TINCR作為ceRNA，競(jìng)爭(zhēng)性地吸收miR-195-3p

為了揭示TINCR潛在的調(diào)控機(jī)制，我們首先探索了TINCR在LncLocator中的預(yù)測(cè)位置。推測(cè)TINCR主要位于細(xì)胞質(zhì)中(圖4A)。TINCR在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的QRT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論(圖4B)?；谶@些結(jié)果，我們假設(shè)TINCR作為一個(gè)ceRNA發(fā)揮作用。為了找到結(jié)合的miRNA，我們對(duì)經(jīng)TINCR敲除后的HepG2的miRNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-195-3p是顯著增加的miRNA之一，其fold change值最大(圖4C)。接下來(lái)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)miR-195-3p降低了野生型TINCR基因片段的熒光素酶活性，而不是突變型TINCR載體(圖4D-E)。我們通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了TINCR和miR-195-3p在HCC細(xì)胞中的表達(dá)值相反。結(jié)果顯示，miR-195-3p在TINCR抑制后上調(diào)，在TINCR過(guò)表達(dá)后下調(diào)(圖4F-G)。相比之下，過(guò)表達(dá)miR-195-3p時(shí)，TINCR下調(diào)(圖4H)。RNA拉下實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，生物素標(biāo)記的miR195-3p轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中，TINCR的表達(dá)占總輸入量的比例顯著升高(圖4I)。最后，來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和Starbase的調(diào)查結(jié)果表明，miR-195-3p與TINCR呈負(fù)相關(guān)，并可能作為一種在臨床病理特征和生存預(yù)測(cè)方面與TINCR相反趨勢(shì)的腫瘤抑制分子(圖4J-K)。以上結(jié)果提示，TINCR的致癌作用部分是通過(guò)miR-195-3p的負(fù)調(diào)控介導(dǎo)的。

4）TINCR緩解miR-195-3p對(duì)ST6GAL1的抑制，增強(qiáng)NF-κ B通路

為了找到miR-195-3p的下游靶蛋白，我們?cè)?/span>TargetScan中篩選了累積加權(quán)上下文評(píng)分小于?0.1的靶基因。在這些預(yù)測(cè)目標(biāo)基因，ST6GAL1是可能的候選基因。我們發(fā)現(xiàn)ST6GAL1的表達(dá)受miR-195-3p變化的影響(圖5A-B)。為了驗(yàn)證這種潛在的相互作用，雙熒光素酶報(bào)告分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-195-3p會(huì)降低野生型ST6GAL1基因片段的熒光素酶活性，但不會(huì)降低突變型ST6GAL1載體(圖5C-D)。這些結(jié)果表明ST6GAL1是miR-195-3p的靶基因。此外，western blotting結(jié)果顯示ST6GAL1的表達(dá)與TINCR的表達(dá)呈正相關(guān)(圖5E-F)，我們進(jìn)一步用GEO數(shù)據(jù)集(GSE54236，圖5G)驗(yàn)證了這一點(diǎn)。為了尋找潛在的信號(hào)通路，基于TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA分析。結(jié)果顯示，包括NF-κB通路在內(nèi)的多個(gè)經(jīng)典通路相關(guān)基因組均顯著富集了TINCR的高表達(dá)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默TINCRs蛋白水平后ST6GAL1降低，IκBα (p-IκBα)和p65 (p-p65)的磷酸化水平降低。抑制miR-195-3p可部分逆轉(zhuǎn)上述作用(圖5H)。相比之下，TINCR過(guò)表達(dá)增加了ST6GAL1蛋白水平以及IκBα (p-IκBα)和p65 (p-p65)的磷酸化水平，而過(guò)表達(dá)miR-195-3p可部分逆轉(zhuǎn)這一變化(圖5I)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們提出TINCR通過(guò)吸收miR-195-3p上調(diào)ST6GAL1，并激活NF-κB通路。

5）ST6GAL1負(fù)責(zé)TINCR介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)展和奧沙利鉑不敏感

為了證實(shí)TINCR介導(dǎo)的ST6GAL1的功能，我們?cè)?/span>TINCR敲除的基礎(chǔ)上，用ST6GAL1過(guò)表達(dá)載體或空載體轉(zhuǎn)染HuH7和HepG2細(xì)胞。細(xì)胞功能檢測(cè)顯示，ST6GAL1表達(dá)的恢復(fù)在一定程度上挽救了細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的下降(圖6A-E)，以及奧沙利鉑耐藥情況(圖6F)。此外，ST6GAL1的恢復(fù)還部分彌補(bǔ)了IκBα (p- IκBα)和p65 (p-p65)磷酸化減弱的水平，而ST6GAL1過(guò)表達(dá)則表現(xiàn)出相反的作用(圖6G-H)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說(shuō)明了TINCR通過(guò)TINCR/miR-195-3p/ST6GAL1/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)了肝癌細(xì)胞進(jìn)展和對(duì)奧沙利鉑的耐藥(圖6I)。

6）在體內(nèi)，沉默TINCR可損害肝細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)生和對(duì)奧沙利鉑的耐藥性

為了驗(yàn)證TINCR在體內(nèi)的致瘤功能，將TINCR沉默的裸鼠皮下接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HuH7細(xì)胞，建立異種移植小鼠模型。qRT-PCR證實(shí)了TINCR基因的下調(diào)程度(圖7A)。與scramble對(duì)照組相比，sh-TINCR組腫瘤大小和重量的生長(zhǎng)均受到強(qiáng)烈抑制。sh-TINCR組腫瘤對(duì)奧沙利鉑治療的敏感性明顯高于ctrl-TINCR組(圖7B-D)。同時(shí)，ST6GAL1在腫瘤組織中的表達(dá)隨著TINCR的沉默而降低(圖7E-F)。這些數(shù)據(jù)表明，沉默TINCR可以抑制肝癌細(xì)胞增殖和體內(nèi)奧沙利鉑耐藥。

結(jié)論：本研究確定了TINCR在HCC中是一種致癌lncRNA，并通過(guò)TINCR/miR-195-3p/ ST6GAL1調(diào)控軸闡明了其在促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和奧沙利鉑耐藥中的作用。我們的數(shù)據(jù)可能有助于更深入地理解與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的機(jī)制，并有助于開(kāi)發(fā)更有效的肝癌患者化療的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：Mei J, Lin W, Li S, Tang Y, Ye Z, Lu L, Wen Y, Kan A, Zou J, Yu C, Wei W, Guo R. Long noncoding RNA TINCR facilitates hepatocellular carcinoma progression and dampens chemosensitivity to oxaliplatin by regulating the miR-195-3p/ST6GAL1/NF-κB pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jan 3;41(1):5. doi: 10.1186/s13046-021-02197-x. PMID: 34980201; PMCID: PMC8722212.