iASPP抑制gp78介導(dǎo)的TMCO1降解，維持Ca2+穩(wěn)態(tài)，控制腫瘤生長和耐藥

從細(xì)胞增殖到凋亡，Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放是調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要事件，由多種生物過程協(xié)調(diào)。Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)與各種癌癥特征有關(guān)。本研究探討已報(bào)道的Ca2+通道蛋白TMCO1在結(jié)腸癌組織中的作用機(jī)制。本研究于2022年1月發(fā)表《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》，IF=9.412。

本文技術(shù)路線：

1、TMCO1蛋白在結(jié)腸癌中高表達(dá)

在肺腺癌(LUAD)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)、胃腺癌(STAD)和結(jié)腸腺癌(COAD) 等不同類型的癌癥中(Figure 1A)，TMCO1的含量顯著增加。其中COAD表現(xiàn)出最高的表達(dá)量變化(Figure 1A)。Western blot (WB)進(jìn)一步驗(yàn)證了40對(duì)結(jié)腸癌組織及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)TMCO1蛋白在結(jié)腸癌組織中上調(diào)(Figure 1B)。作者還發(fā)現(xiàn)，TMCO1蛋白的高表達(dá)與結(jié)腸癌晚期顯著相關(guān)，但與性別和年齡無關(guān)(Figure 1C,D)。作者的RT-PCR結(jié)果顯示，TMCO1 mRNA在結(jié)腸癌中也沒有明顯變化(Figure 1E)。為了探討這一點(diǎn)，作者采用COAD作進(jìn)一步分析。與體內(nèi)結(jié)果一致的是，TMCO1蛋白在蛋白水平上增加，而在mRNA水平上沒有增加(Figure. 1F)。作者還發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑氯喹(CQ)，提高了TMCO1蛋白的表達(dá)，提示TMCO1可以被蛋白酶體降解所調(diào)節(jié)（Figure. 1G），H)。已有研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白的蛋白酶體降解主要由多聚泛素化介導(dǎo)。與此一致，TMCO1被發(fā)現(xiàn)具備多泛素化特征（Figure. 1I）。

Fig 1 TMCO1蛋白在人結(jié)腸癌組織中過表達(dá)

2．TMCO1是E3連接酶Gp78的底物

作者想知道TMCO1蛋白的變化是否影響其在COAD中的激活。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者首先探索了可能參與調(diào)控TMCO1蛋白穩(wěn)定性的E3連接酶，通過抑制ER定位的E3連接酶的表達(dá)來測定其蛋白水平。結(jié)果表明，結(jié)果表明，Gp78、RNF5、RNF185基因敲除可增加TMCO1的表達(dá)，而HRD1、SPFH1、TMEM129基因敲除則不能增加TMCO1的表達(dá)(Figure 2A)。IP檢測顯示，Gp78存在于外源表達(dá)的TMCO1沉淀中，而RNF185和RNF5都不可能與TMCO1結(jié)合(Figure 2B)。TMCO1與Gp78的直接相互作用進(jìn)一步在體外得到驗(yàn)證 (Figure 2C)。因此，作者推斷TMCO1可能是Gp78的底物。

Gp78 過表達(dá)降低了TMCO1蛋白的穩(wěn)態(tài)水平，而加入MG132后，TMCO1蛋白的穩(wěn)態(tài)水平?jīng)]有進(jìn)一步降低證實(shí)了這一觀點(diǎn)(Figure 2D)。此外，野生型(WT) Gp78泛素化TMCO1(Figure 2E)。與此一致，缺陷的K48R泛素突變體阻止了TMCO1泛素鏈的形成(Figure 2F)。此外， siRNA介導(dǎo)了Gp78KD幾乎完全消除了TMCO1 K48的泛素化

通過生物信息學(xué)預(yù)測工具，發(fā)現(xiàn)K40、K116、K160、K172和K186最有可能是被泛素化修飾的位點(diǎn)。為了驗(yàn)證生物信息學(xué)結(jié)果，作者構(gòu)建了泛素化缺陷TMCO1突變體(K40R、K116R、K160R、K172R和K186R)。分別將單個(gè)突變體引入HT-29細(xì)胞后進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)。如圖所示，K186R-TMCO1基本喪失了被泛素化的能力，其他突變體的泛素化程度與WT TMCO1相似(Figure 2G)。環(huán)己酰亞胺(CHX)被廣泛用于抑制真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。經(jīng)CHX處理后，TMCO1在對(duì)照細(xì)胞中的半衰期為4 h，K186R-TMCO1比野生型TMCO1更長(Figure 2H)。而Gp78未降低K186R-TMCO1的表達(dá)(Figure 2I)。說明Gp78在K186位點(diǎn)催化TMCO1的泛素化，導(dǎo)致其泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。

Fig 2 TMCO1是Gp78的底物

3、在結(jié)腸癌組織中，癌基因iASPP和TMCO1相互關(guān)聯(lián)

通過WB,檢測發(fā)現(xiàn)Gp78在結(jié)腸癌標(biāo)本與配對(duì)的相鄰正常對(duì)照的表達(dá)水平無明顯差異(Figure 3A，B)。同時(shí)檢測Gp78和TMCO1，發(fā)現(xiàn)兩者之間沒有明顯的相關(guān)性(Figure 3C)。作者使用anti-Gp78下拉進(jìn)行質(zhì)譜分析，尋找Gp78相互作用的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)眾所周知的致癌基因iASPP(Figure 3D)。作者還發(fā)現(xiàn)，與相鄰的正常對(duì)照組相比，iASPP在結(jié)腸癌組織中增加(Fig. 3E)。與TMCO1一樣，iASPP表達(dá)與晚期結(jié)腸癌相關(guān)(Figure 3F)。此外，TMCO1的增加與iASPP的增加呈正相關(guān)(Figure 3G)，說明iASPP的表達(dá)與TMCO1在體內(nèi)的表達(dá)有關(guān)。

Fig 3癌基因iASPP和TMCO1在結(jié)腸癌組織體內(nèi)相互關(guān)聯(lián)

4、iASPP保護(hù)TMCO1免受泛素-蛋白酶體降解

用iASPP 過表達(dá)或敲低檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系中TMCO1的水平。值得注意的是，當(dāng)iASPP過表達(dá)時(shí)，TMCO1持續(xù)且顯著增加，iASPP敲低將會(huì)抑制TMCO1表達(dá)(Figure 4A)。但 iASPP對(duì)TMCO1 mRNA表達(dá)沒有影響(Figure 4A)。而MG132卻不能完全拯救iASPP 敲低引起的TMCO1抑制(Figure 4B)。與對(duì)照組4個(gè)小時(shí)的半衰期相比，iASPP過表達(dá)的細(xì)胞半衰期延長到12小時(shí)左右，而iASPP敲低的細(xì)胞在半衰期縮短至1小時(shí)左右(Figure 4C，D)。此外，iASPP 過表達(dá)抑制TMCO1多聚泛素化，而iASPP 敲低則增加了TMCO1多聚泛素化(Figure 4E，F)。這些數(shù)據(jù)共同表明，致癌基因iASPP保護(hù)TMCO1免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。此外，iASPP調(diào)控的TMCO1表達(dá)被Gp78 敲低完全消除(Fig. 4G)。這并不是由于iASPP蛋白本身的變化，因?yàn)?/span>Gp78kd對(duì)iASPP表達(dá)無明顯影響(Fig. 4G)。此外，與WT TMCO1及泛素化位點(diǎn)無關(guān)TMCO1突變體(K116R)相比，泛素化缺陷TMCO1 K186R對(duì)iASPP介導(dǎo)的TMCO1增加具有高度耐藥性(Fig. 4H)。因此，iASPP通過依賴Gp78的方式穩(wěn)定TMCO1。

Fig 4 iASPP保護(hù)TMCO1免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解

5、iASPP通過與Gp78競爭性結(jié)合穩(wěn)定TMCO1

作者觀察到Gp78、TMCO1和iASPP形成復(fù)合物(Figure 5A)，這與之前的質(zhì)譜結(jié)果一致。此外，iASPP 過表達(dá)降低了Gp78與TMCO1的結(jié)合(Figure 5A)。因此，有理由認(rèn)為iASPP可能通過抑制Gp78與TMCO1的結(jié)合來發(fā)揮作用。如果是這種情況，iASPP可能與Gp78或TMCO1相關(guān)聯(lián)。為驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，使用體外翻譯或重組的iASPP、Gp78和TMCO1蛋白進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，iASPP與Gp78共沉淀，只有Gp78存在時(shí)，iASPP才與TMCO1發(fā)生相互作用(Fig. 5B)。因此，說明iASPP直接與Gp78相互作用，而不與TMCO1相互作用。

作者構(gòu)建了4個(gè)Gp78截?cái)嗤蛔凅w，如圖5C所示。一個(gè)抗v5標(biāo)簽抗體的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示v5標(biāo)記的TMCO1與WT-和F2(301-400)-共免疫沉淀，且兩者都含有Ring結(jié)構(gòu)域，而沒有其他結(jié)構(gòu)域，表明Ring結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span>Gp78與TMCO1的結(jié)合是必不可少的(Fig. 5D)。通過體外IP分析，作者發(fā)現(xiàn)(301-400)Gp78，即與TMCO1結(jié)合的區(qū)域，也有助于與iASPP結(jié)合(Figure 5E)，進(jìn)一步支持了iASPP與TMCO1在Gp78結(jié)合方面存在競爭的假設(shè)。在iASPP蛋白增加的情況下比較TMCO1和Gp78兩者之間的結(jié)合能力。發(fā)現(xiàn)兩隨著iASPP與Gp78結(jié)合程度的增加，TMCO1和Gp78逐漸降低(Fig. 5F)。這些數(shù)據(jù)表明，iASPP與TMCO1競爭獲得與(301-400)Gp78結(jié)合，增加TMCO1穩(wěn)定性(Fig. 5G)。

Fig 5 iASPP通過與Gp78競爭性結(jié)合穩(wěn)定TMCO1

6、iASPP通過穩(wěn)定TMC01 調(diào)節(jié)ER Ca2+的貯藏

鑒于TMCO1是一種Ca2+通道蛋白，iASPP對(duì)TMCO1具有調(diào)節(jié)作用，作者進(jìn)一步研究了iASPP對(duì)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用。為此，作者測量了HT-29和HCT-116細(xì)胞的Ca2+情況。游離Ca2+條件下存在離子霉素。離子霉素能導(dǎo)致Ca2+快速泄漏。因此檢測到的胞質(zhì)Ca2+通量間接反映了Ca2+含量。在這種條件下，用曲線下面積(AUC)定量的胞質(zhì)Ca2+信號(hào)，值得注意的是，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，iASPP過表達(dá)顯著降低了AUC(Figure 6A，B)，而iASPP過表達(dá)顯著提高了AUC(Figure 6C，D)。此外，iASPP對(duì)離子霉素誘導(dǎo)的Ca2+的影響隨著TMCO1敲低完全消除。iASPP主要通過控制TMCO1蛋白水平來調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)。

Fig 6 Ca2+通道蛋白TMCO1是iASPP調(diào)控ER Ca2+含量所必需的

7、ASPP-TMCO1在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)腫瘤生長

TMCO1 敲低在軟瓊脂實(shí)驗(yàn)中顯著減少HT-29和HCT-116細(xì)胞的集落形成，iASPP 敲低也起了類似的效果，而兩者聯(lián)合后沒有進(jìn)一步影響擊落形成(Figure 7A)。iASPP-TMCO1對(duì)腫瘤生長的影響也通過裸鼠異種移植模型在體內(nèi)進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是iASPP還是TMCO1的敲低都能降低腫瘤生長和重量(Figure 7B，C)。不同移植瘤模型小鼠的體重?zé)o明顯變化(Figure 7D)。與體外數(shù)據(jù)一致，作者發(fā)現(xiàn)iASPP 敲低導(dǎo)致異種移植瘤中TMCO1減少(Figure 7E)。此外，iASPP和TMCO1 敲低可增加細(xì)胞凋亡率，但同時(shí)敲低并不能進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Figure 7F)。

Fig 7 iASPP-TMCO1在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)腫瘤生長

8、ASPP-TMCO1軸能降低凋亡Ca2+信號(hào)

用TG或組胺刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，并檢測對(duì)照組及iASPP或TMCO1敲低對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG或組胺處理24 h后，凋亡水平(如caspase 3/7活性和 膜聯(lián)蛋白v陽性率)增加(Figure 8A，B)。無論是在無應(yīng)激條件下還是在TG或組胺處理?xiàng)l件下，iASPP或TMCO1敲低的細(xì)胞中， 膜聯(lián)蛋白v凋亡細(xì)胞的百分比比對(duì)照組高得多(Figure 8A，B)。然而，在Ca2+非依賴性凋亡誘導(dǎo)劑依托泊苷的作用下，iASPP敲低促進(jìn)了凋亡敏感性(Figure 8A，B)。iASPP敲低顯著抑制了十字孢堿作用下HT-29細(xì)胞的集落形成。TMCO1敲低具有相似的效果，但是

兩者同時(shí)敲低并沒有進(jìn)一步抑制集落形成(Figure 8C)。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了iASPP-TMCO1在HT-29異種移植模型小鼠體內(nèi)的作用。十字孢堿抑制腫瘤生長，iASPP或TMCO1都能誘導(dǎo)HT29異種移植瘤對(duì)十字孢堿的反應(yīng)。然而，兩者同時(shí)敲低并沒有產(chǎn)生額外的效應(yīng)(Fig. 8D–F)。此外，在異種抑制瘤中，通過WB證實(shí)了iASPP敲低和TMCO1敲低的有效性。此外，iASPP敲低抑制了TMCO1的表達(dá)(Figure. 8G)。同樣的，通過抑制iASPP或TMCO，十字孢堿誘導(dǎo)的凋亡增加，但兩者同時(shí)敲低并沒有進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡(Figure. 8H)。這些數(shù)據(jù)共同表明，抑制iASPP-TMCO1軸使癌細(xì)胞對(duì)Ca2+調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡敏感。

Fig 8抑制iASPP-TMCO1軸增加了在體內(nèi)和體外十字孢堿敏感性

本研究闡明了iASPP調(diào)控Gp78介導(dǎo)TMCO1降解，導(dǎo)致Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，并增Ca2+引發(fā)的細(xì)胞凋亡的抗性。這些發(fā)現(xiàn)提示了能通過調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)來治療癌癥。

參考文獻(xiàn)：

Zheng, S., et al., iASPP suppresses Gp78-mediated TMCO1 degradation to maintain Ca(2+) homeostasis and control tumor growth and drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022. 119(6).