環(huán)狀RNA circHERC4作為一種新的致癌驅(qū)動因子，通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin軸促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌（CRC）患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明，circRNA在癌癥的起始和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，circRNAs協(xié)同癌癥轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步澄清。因此，目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進(jìn)腫瘤侵襲性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物，證明CircHERC4可作為CRC患者的一個可開發(fā)的治療靶點(diǎn)。該研究發(fā)表在《Journal of Hematology＆Oncology》，IF: 17.388。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 結(jié)腸癌中circHERC4的識別和特征

作者選擇結(jié)腸癌組織和配對的相鄰非腫瘤組織進(jìn)行RNA序列分析，以獲得CircRNA的表達(dá)譜。根據(jù)fold change ≥10.0 和P< 0.05，篩選了轉(zhuǎn)移相關(guān)的CircRNA，最后應(yīng)用transwell侵襲試驗篩選出功能性CircRNA，最終篩選出circHERC4（has_circ_0007113）（圖1a）。通過RNase R和放線菌素D處理后，HERC4 mRNA水平顯著下調(diào)，而circHERC4 mRNA水平保持不變(圖1c, d)。此外，通過核質(zhì)分離后的qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)circHERC4主要位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1e)。

圖1 circHERC4在CRC細(xì)胞中的鑒定和表征

2. circHERC4而非HERC4 mRNA的過度表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)

qRT-PCR檢測120對組織樣本（120個癌組織和120個正常組織）中circHERC4的表達(dá)。結(jié)果表明，在結(jié)腸癌患者中，circHERC4的表達(dá)顯著增加（P<0.001）（圖2a）。circHERC4的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移（P<0.01）（圖2b）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（主要是肝轉(zhuǎn)移）呈正相關(guān)（P<0.01）（圖2c）。對具有臨床特征的120例結(jié)腸癌患者進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)circHERC4表達(dá)與病理分期和組織學(xué)分級相關(guān)（表1）。circHERC4的過度表達(dá)與結(jié)腸癌中宿主HERC4mRNA無關(guān)（圖2d）。Kaplan-Meier生存分析顯示，circHERC4高表達(dá)的患者總體生存率較低（P<0.05）（圖2g）。HERC4 mRNA表達(dá)水平與患者預(yù)后無關(guān)（圖2h）。綜上所述，這些結(jié)果表明，circHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)在CRC組織中顯著上調(diào)，而更高的circHERC4表達(dá)可能意味著預(yù)后不良。

圖2 CircHERC4在CRC組織中過表達(dá)并與轉(zhuǎn)移相關(guān)

表1 circHERC4低表達(dá)和高表達(dá)的CRC患者的臨床特點(diǎn)

3. CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內(nèi)促進(jìn)CRC的增殖、遷移和侵襲

為了確定circHERC4的功能作用，檢測了circHERC4在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞、HCoEpic和CRC細(xì)胞(HCT116、DLD-1、HT29、LoVo和SW480)中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circHERC4在CRC細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，其中與HCoEpic細(xì)胞相比，circHERC4在DLD-1和HCT116細(xì)胞中的表達(dá)相對較高，而在SW480細(xì)胞中的表達(dá)相對較低(圖3a)。因此，選擇HCT116、DLD-1和SW480細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。首先設(shè)計了針對circHERC4剪接序列的siRNAs(圖3b)。DLD-1和HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染circHERC4 siRNA，其成功沉默circHERC4，但未沉默HERC4 mRNA（圖3c）。根據(jù)CCK-8實驗，沉默circHERC4顯著抑制了DLD-1和HCT116細(xì)胞的活力(圖3d)。集落形成實驗顯示，與NC相比，circHERC4下調(diào)組的DLD-1和HCT116細(xì)胞增殖能力也受到抑制(圖3e)。此外，transwell實驗顯示，沉默circHERC4抑制了DLD-1和HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖3f)。過表達(dá)circHERC4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)circHERC4明顯增加(圖3g)。結(jié)果表明，circHERC4過表達(dá)顯著促進(jìn)了體外CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖3h-j)。

異種移植和轉(zhuǎn)移小鼠模型也支持circHERC4在體內(nèi)發(fā)揮致癌作用的觀點(diǎn)。干擾circHERC抑制腫瘤的生長速度和腫瘤重量 (圖3k-m)。與陰性對照組相比，sh-circHERC4組肺、肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率顯著降低(圖3n)。HE染色顯示sh-NC組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積極高，而sh-circHERC4組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積顯著降低(圖3o)。以上數(shù)據(jù)證實了circHERC4在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)CRC的進(jìn)展，特別是轉(zhuǎn)移。

圖3 CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)增殖、遷移和侵襲

4. CircHERC4在CRC細(xì)胞中直接與miR-556-5p結(jié)合

在雙熒光素酶報告實驗中，miR-556-5p具有最大的熒光素酶活性抑制作用(圖4a)。RNA pull-down實驗后的qPCR結(jié)果顯示，circHERC4 mRNA顯著富集，而宿主HERC4 mRNA則不顯著富集。通過qPCR檢測circHERC4 pull-down部分中所有具有熒光素酶活性抑制作用的7個miRNA。circHERC4 pull-down部分中miR-556-5p的富集顯著高于NC組和其他miRNAs(圖4b)。這些結(jié)果提示miR-556-5p直接與circHERC4結(jié)合，并可能參與了circHERC4在CRC中的功能。

圖4 CircHERC4通過與miR-556-5p相互作用促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

5. 抑制miR-5565p可介導(dǎo)circHERC4的致癌功能，激活CRC中的Notch信號通路

qPCR檢測證實了miR-556-5p在CRC組織中下調(diào)(圖4c)，miR-556-5p在有淋巴轉(zhuǎn)移(圖4d)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(圖4e)患者中的表達(dá)水平要低得多。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者miR-556-5p水平較低，而其他特征與miR-556-5p的表達(dá)無顯著相關(guān)性(表2)。miR-556-5p能顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖4f-h)。拯救實驗中miR-556-5p模擬物可以部分恢復(fù)過表達(dá)circHERC4增強(qiáng)的SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖4i-k)。綜上所示，這些結(jié)果提供了證據(jù)，表明miR-556-5p具有抗癌作用，并通過直接結(jié)合CRC部分介導(dǎo)circHERC4的致癌功能。

根據(jù)維恩圖(圖5a)，篩選出了9109個在circHERC4沉默和miR-556-5p過表達(dá)的DLD-1細(xì)胞中顯著改變的轉(zhuǎn)錄本。KEGG通路富集分析顯示，這9109個轉(zhuǎn)錄本富集在許多腫瘤相關(guān)信號通路中，尤其是與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的Notch信號通路(圖5b)。因此， circHERC4可能通過激活Notch信號通路促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而Notch信號通路可能被miR-556-5p阻斷。

圖5 CTBP2是miR-556-5p的靶基因

6. CTBP2是miR-556-5p的靶點(diǎn)，通過抑制E-cadherin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)而發(fā)揮致癌作用

熱圖顯示Notch信號通路中大部分基因通過沉默circHERC4和過表達(dá)miR-556-5p而下調(diào)(圖5c)。結(jié)合生物信息學(xué)分析，CTBP2被預(yù)測為miR-556-5p的靶點(diǎn)(圖5d)。熒光素酶報告實驗表明miR-556-5p的過表達(dá)顯著降低了包括CTBP2野生型結(jié)合位點(diǎn)而不包括突變型結(jié)合位點(diǎn)的載體的熒光素酶活性(圖5d)。Western blot實驗證明，miR-556-5p可以顯著抑制CTBP2的蛋白水平，但卻挽救了CTBP2靶向E-cadherin的表達(dá)(圖5e)。

GEPIA數(shù)據(jù)庫和免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)CTBP2蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織上調(diào)(圖6a,b)。Kaplan Meier生存分析評估CTBP2高表達(dá)與CRC患者較低的生存概率顯著相關(guān)(圖6c)。敲除CTBP2促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降(圖6d)。與NC相比，沉默CTBP2顯著抑制了細(xì)胞增殖 (圖6e-g)，這些結(jié)果為CTBP2是miR-556-5p的靶基因，其過表達(dá)通過抑制E-cadherin介導(dǎo)CRC腫瘤轉(zhuǎn)移提供了重要的認(rèn)識。

圖6 CTBP2在CRC組織中過表達(dá)，可促進(jìn)CRC細(xì)胞的進(jìn)展

7. 沉默CTBP2可以消除過度表達(dá)circHERC4所引起的效應(yīng)

當(dāng)circHERC4被敲低時，CTBP2蛋白水平顯著下降。相反，CTBP2的下游靶蛋白E-cadherin在這些條件下顯著增加(圖6h)，Ki-67在circHERC4沉默后急劇下調(diào)(圖6i)。挽救實驗來研究circHERC4和CTBP2之間的功能相互作用。與轉(zhuǎn)染空載體或siNC模擬物的SW480細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CTBP2 siRNA模擬物的過表達(dá)circHERC4細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降(圖6j-l)，circHERC4的致癌功能可以通過消除CTBP2的表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)。Western blotting結(jié)果顯示，CTBP2可以部分恢復(fù)circHERC4對E-cadherin表達(dá)的影響(圖6m)。circHERC4和CTBP2在高級別CRC組織中過表達(dá)，而miR-556-5p在低級別CRC組織中更豐富(圖7a)。異種皮下移植的結(jié)果表明，circHERC4過表達(dá)可加速腫瘤生長，注射CTBP2 siRNA或miR-556-5p mimic后，這種作用可被抑制(圖7b-d)。免疫組化實驗表明，沉默CTBP2或過表達(dá)miR-556-5p來部分挽救circHERC4對CTBP2 和Ki67促進(jìn)、E-cadherin抑制的作用。在尾靜脈注射小鼠模型中，上調(diào)circHERC4可促進(jìn)肺和肝臟轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的形成，當(dāng)CTBP2下調(diào)或miR-556-5p上調(diào)時，circHERC4誘導(dǎo)的致癌作用被阻斷(圖7f-g)?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明CTBP2可以促進(jìn)CRC的進(jìn)展，并且在體內(nèi)和體外都受到circHERC4/miR-556-5p軸的調(diào)控。

圖7 CTBP2受circHERC4/miR-556-5p相互作用的調(diào)控

研究結(jié)論：

綜上所述，該報告發(fā)現(xiàn)了一個之前未被發(fā)現(xiàn)的致癌驅(qū)動因子circHERC4在CRC組織中升高，并與CRC的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。此外，circHERC4在CRC患者中的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移和較差的生存率呈正相關(guān)。作者提出了circHERC4可以阻斷miR-556-5p對CTBP2的抑制活性的機(jī)制。因此，沉默circHERC4可以下調(diào)CTBP2的表達(dá)，并伴隨E-cadherin的激活。該研究結(jié)果表明，circHERC4可能是一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，沉默circHERC4為CRC治療提供了一個新的治療靶點(diǎn)(圖8)。

圖8 circHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信號通路促進(jìn)CRC發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制示意圖

參考文獻(xiàn)：
He J, Chu Z, Lai W, et al. Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021; 14(1):194.