晝夜節(jié)律基因NFIL3的高表達通過抑制NFKBIA轉(zhuǎn)錄而激活NF-κB信號通路，從而促進TNBC的進展

流行病學研究證實，晝夜節(jié)律異常與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。然而，很少有研究探討節(jié)律基因在乳腺癌進展中的病理作用。目前，有研究發(fā)現(xiàn)節(jié)律基因NFIL3在體外和體內(nèi)均能促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，該研究發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. NFIL3 mRNA的減少表明，通過篩查乳腺癌節(jié)律基因的異常表達，TNBC中NFIL3蛋白升高

作者從基于TCGA數(shù)據(jù)集和GTEx數(shù)據(jù)集，搜索GEPIA數(shù)據(jù)庫，研究了32個節(jié)律基因在乳腺癌中的異常表達，其中與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中CRY2、NFIL3、PER1、EGR3、NR1D1和TIMELESS 6個節(jié)律基因的表達發(fā)生了顯著變化（圖1A）。q-PCR結(jié)果驗證了這6個節(jié)律基因在臨床樣本的mRNA水平，證實了NFIL3和EGR3在乳腺癌中的異常表達與GEPIA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果一致(圖1B)。EGR3 mRNA在HER2陽性乳腺癌亞型中顯著下調(diào)，而NFIL3 mRNA在TNBC亞型中特異性低于其他亞型乳腺癌(圖1C)。因此，作者選擇NFIL3做后續(xù)研究。免疫組化評估NFIL3蛋白在TNBC和其他亞型乳腺癌之間的表達，發(fā)現(xiàn)NFIL3蛋白在TNBC中的表達明顯高于其他亞型乳腺癌(圖1D)，這與NFIL3在TNBC中的表達模式的mRNA水平相反(圖1C)。此外， NFIL3蛋白高表達與TNBC患者預后不良相關(guān)(圖1E)。

ChIP (圖1F)和雙熒光素酶報告基因 (圖1G)證明NFIL3可以結(jié)合NFIL3基因的啟動子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄。這表明NFIL3是NFIL3基因轉(zhuǎn)錄的抑制因子，這可能解釋了NFIL3在mRNA和蛋白水平上的相反變化。后續(xù)作者發(fā)現(xiàn)隨著外源性NFIL3蛋白的增加，NFIL3的pre-mRNA顯著下調(diào)(圖1I)。這些結(jié)果表明，NFIL3是NFIL3轉(zhuǎn)錄的一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且NFIL3 mRNA的下降表明癌癥中NFIL3蛋白水平的升高。

圖1 NFIL3 mRNA下降提示TNBC中NFIL3蛋白升高

2. NFIL3蛋白促進TNBC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移

為了檢測NFIL3蛋白在TNBC進展中的潛在作用，分別通過功能獲得和功能缺失實驗研究了NFIL3蛋白對兩種TNBC細胞株BT549和Hs578T增殖和轉(zhuǎn)移的影響：增加NFIL3蛋白促進Hs578T細胞增殖(圖2A-B)，而內(nèi)源性NFIL3基因的下調(diào)抑制了Hs578T細胞的增殖(圖2C, D)；上調(diào)NFIL3蛋白可促進Hs578T細胞的生長(圖2E)，而下調(diào)NFIL3蛋白可抑制Hs578T細胞的生長(圖2F)；過度NFIL3蛋白質(zhì)促進Hs578T細胞遷移和入侵(圖2),而減少NFIL3蛋白抑制細胞遷移和入侵 (圖2 j-l)；上調(diào)NFIL3蛋白可促進Hs578T細胞的肺轉(zhuǎn)移(圖2M)，而下調(diào)NFIL3蛋白可抑制Hs578T細胞的肺轉(zhuǎn)移(圖2N)。這些表明NFIL3蛋白可促進TNBC細胞在體外和體內(nèi)的進展。

圖2 NFIL3促進TNBC細胞在體外和體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移

3. NFIL3調(diào)節(jié)乳腺癌中的腫瘤相關(guān)炎癥

作者使用mRNA陣列檢測了NFIL3敲除后的整體基因表達變化。功能富集分析表明，下調(diào)和上調(diào)的基因在炎癥中均顯著富集(圖3A, B)。NFIL3敲除影響的主要炎癥通路：先天免疫信號通路和適應(yīng)性免疫信號通路顯著豐富(圖3C)?；?/span>TCGA數(shù)據(jù)集，分析NFIL3 mRNA水平與乳腺癌組織中22個炎性細胞浸潤的相關(guān)性(圖3D-E)：NFIL3 mRNA水平與I型巨噬細胞(M1)、CD4+記憶T細胞、CD8+ T細胞、樹突狀細胞(DCs)、濾泡T輔助細胞、M0細胞和中性粒細胞的浸潤水平呈正相關(guān)(圖3D)，而與Treg細胞、II型巨噬細胞(M2)、單核細胞、靜息肥大細胞、na?ve CD4+ T細胞、γδ T細胞和嗜酸性粒細胞水平呈負相關(guān)(圖3E)。此外，在60個TNBC組織中檢測了NFIL3蛋白水平與浸潤M1、M2、CD8+T細胞數(shù)量的相關(guān)性，證實NFIL3蛋白水平與浸潤M2細胞呈正相關(guān)，與浸潤M1細胞、CD8+T細胞呈負相關(guān)(圖3F-G)。這些結(jié)果表明，NFIL3在乳腺癌中調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的炎癥。

圖3 NFIL3調(diào)節(jié)乳腺癌中的癌相關(guān)炎癥

4. NFIL3通過抑制TNBC細胞中NFKBIA的表達增強NF κB信號通路的活性

NF-κB信號通路是一個與癌癥進展相關(guān)的炎癥通路，在NFIL3調(diào)控的十大炎癥信號通路中富集(圖3C)。免疫熒光實驗中，TNF-α刺激后，NF-κB迅速從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核，NFIL3蛋白的過表達顯著增強NF-κB在不同時間點入核的轉(zhuǎn)位，而NFIL3蛋白的減少阻斷了NF-κB的核轉(zhuǎn)位(圖4A)。隨后，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，過表達NFIL3蛋白顯著增強NF-κB活性，而敲低NFIL3蛋白顯著抑制NF-κB活性(圖4B)。這些結(jié)果表明，NFIL3能有效促進TNBC細胞NF-κB的活化。

考慮到NFIL3是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，NF-κB激活的典型抑制因子NFKBIA在NFIL3敲除細胞中顯著上調(diào)，將NFKBIA作為NFIL3的直接靶點進行進一步研究。采用ChIP試驗和雙熒光素酶報告基因試驗證明，在Hs578T細胞中，NFIL3結(jié)合NFKBIA基因(圖4C)并抑制其轉(zhuǎn)錄(圖4D)。NFKBIA在NFIL3過表達細胞中下降，但在NFIL3敲除細胞中，在Hs578T細胞(圖4E-F)。此外，免疫組化檢測乳腺癌組織中NFIL3和NFKBIA的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中NFIL3蛋白水平與NFKBIA蛋白水平呈負相關(guān)(圖4G)。TCGA數(shù)據(jù)集中NFIL3和NFKBIA的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NFIL3 mRNA與NFKBIA mRNA在乳腺癌(圖4H)中均呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明NFKBIA是NFIL3蛋白的直接靶點，在TNBC細胞中被NFIL3轉(zhuǎn)錄抑制。

圖4 NFIL3增強NF-κB信號通路活性，抑制TNBC細胞中NFKBIA的轉(zhuǎn)錄

5. NFKBIA抑制NF-κB信號通路的活性，抑制TNBC細胞在體內(nèi)外的增殖和轉(zhuǎn)移

NF-κB基因的下調(diào)增強了NF-κB從細胞質(zhì)進入細胞核的易位，而NFKBIA的過表達阻斷了Hs578T細胞中NF-κB的核易位(圖5A)。NF-κB活性顯著增強，而NF-κB過表達顯著抑制NF-κB活性(圖5B)。此外，基于TCGA數(shù)據(jù)集，分析NFKBIA mRNA水平與乳腺癌組織中22個炎癥細胞浸潤的相關(guān)性(圖5C, D)，發(fā)現(xiàn)NFKBIA mRNA水平與M1、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和na?ve B細胞的浸潤水平呈正相關(guān)(圖5C)，而根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集，與乳腺癌組織中M2細胞、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤水平呈負相關(guān)(圖5D)。通過免疫組化檢測，乳腺癌組織中NFKBIA蛋白水平與M1、M2和CD8+ T細胞浸潤量的相關(guān)性也得到了證實(圖5E, F)。這些結(jié)果表明，NFKBIA是NF-κB信號通路的抑制因子，與NFIL3不同，它調(diào)控TNBC中腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

圖5 NFKBIA抑制NF-κB信號通路的活性，并與乳腺癌免疫細胞的浸潤相關(guān)

   接下來，通過細胞計數(shù)和克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)過表達NFKBIA抑制了細胞增殖，而下調(diào)NFKBIA則促進了Hs578T細胞(圖6A-D)。NFKBIA的過表達抑制了皮下Hs578T腫瘤的生長(圖6E)，而NFKBIA的下調(diào)促進了裸鼠皮下Hs578T腫瘤的生長(圖6F)。此外，過表達NFKBIA不僅在體外抑制Hs578T細胞(圖6G-I)的遷移和侵襲，而且在小鼠尾靜脈注射模型中降低Hs578T細胞的肺轉(zhuǎn)移(圖6J)。下調(diào)NFKBIA基因可促進Hs578T細胞(圖6K-M)在體外的遷移和侵襲，并增強Hs578T細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移(圖6N)。這些結(jié)果表明，NFKBIA與致癌的NFIL3不同，是一種抑制乳腺癌細胞進展的腫瘤抑制因子。

圖6 NFKBIA抑制TNBC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移

6. NFIL3通過抑制NFKBIA促進NF κB的激活和乳腺癌的進展

為了進一步評價NFKBIA在介導NFIL3對NF-κB激活和TNBC進展的影響中的關(guān)鍵作用，在Hs578T(圖7A)細胞中過表達NFKBIA和NFIL3，并檢測了NFKBIA和NFIL3過表達對NF-κB活性和乳腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲的影響。在過表達NFIL3的乳腺癌細胞中拯救NFKBIA的表達，可以阻斷Hs578T細胞中NFIL3過表達引發(fā)的NF-κB從細胞質(zhì)到細胞核的快速易位(圖7B)。雙熒光素酶報告實驗證實，挽救NFKBIA的表達抑制了NFIL3對NF-κB活性的促進作用(圖7C)。NFKBIA的表達部分逆轉(zhuǎn)了NFIL3對Hs578T細胞(圖7D)的增殖促進作用，以及對Hs578T細胞(圖7E, F)的遷移和侵襲促進作用。這些表明NFIL3通過抑制NFKBIA進而增強NF-κB信號通路的活性，從而促進TNBC的進展。

圖7 NFIL3通過抑制NFKBIA，激活NF-κB炎癥通路，促進TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲

7. 針對NF-κB活性的抗炎策略阻斷了NFIL3蛋白在TNBC中的致癌作用

雙熒光素酶報告實驗檢測到，阿司匹林和Bay11-7082不僅顯著阻斷了NFIL3蛋白介導的NF-κB信號通路的激活(圖7G)，而且顯著抑制了NFIL3對Hs578T細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用(圖7H-J)。此外，阿司匹林顯著抑制了NFIL3對裸鼠Hs578T細胞生長(圖7K)和轉(zhuǎn)移(圖7L)的促進作用。綜上所述，針對NF-κB活性的方法可阻斷了NFIL3蛋白在TNBC中的致癌作用。

主要結(jié)論：

與正常乳腺組織及其他亞型乳腺癌相比，NFIL3蛋白在TNBC中均升高，并通過抑制NFKBIA的表達，激活NF-κB信號通路，促進TNBC細胞的進展。針對NF-κB活性的抗炎策略阻斷了NFIL3在TNBC中的致癌作用。本研究可能為TNBC的防治提供新的靶點。