CircCPM通過激活PRKAA2介導(dǎo)的自噬促進(jìn)胃癌的化療耐藥性

5-氟尿嘧啶（5-FU）是臨床上常用的一種晚期GC的一線化療藥物。然而，其療效因化療耐藥性而顯著減弱。最近，有證據(jù)表明，自噬失調(diào)可能導(dǎo)致癌癥的耐藥性，而CircRNA也參與了化療耐藥性。然而，circRNAs是否通過自噬參與5-FU化療耐藥仍不清楚。circCPM在5-FU耐藥的GC細(xì)胞系和組織中上調(diào)。此外，circCPM高表達(dá)與生存率低呈正相關(guān)。沉默circCPM提高了體外和體內(nèi)的化療敏感性。在機(jī)制上，它直接與細(xì)胞質(zhì)中的miR-21-3p結(jié)合，從而增加PRKAA2的表達(dá)，促進(jìn)自噬和化療耐藥性的激活。我們的結(jié)果顯示，circCPM通過靶向PRKAA2在調(diào)節(jié)GC自噬和5-FU耐藥性方面起著關(guān)鍵作用，為評價(jià)GC的療效和逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥提供了新的理論依據(jù)。本文于2022年1月發(fā)表于“Clinical and Translational Medicine”（IF= 11.492）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）5-FU耐藥GC中的失調(diào)的circRNA

為了研究circRNA和mRNA表達(dá)譜，我們在5-FU耐藥和敏感的GC細(xì)胞和組織中使用circRNA和mRNA微陣列進(jìn)行聯(lián)合分析（圖1A）。我們在5-FU耐藥的GC細(xì)胞系和組織中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個上調(diào)或下調(diào)的CircRNA和mRNA。我們首先通過Targetscan、miRDB、miWALK和Starbase數(shù)據(jù)庫建立了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?？紤]到自噬在耐藥性中的關(guān)鍵作用，我們通過GO和KEGG的clusterProfiler進(jìn)一步分析了包括PARK2、PRKAA2和SOGA3在內(nèi)的自噬途徑相關(guān)基因。接下來，使用癌癥藥物敏感性基因組學(xué)（GDSC）數(shù)據(jù)庫分析這些自噬途徑相關(guān)基因與5-FU敏感性之間的關(guān)系。根據(jù)5-FU藥物敏感性的IC50值，我們發(fā)現(xiàn)PRKAA2表達(dá)上調(diào)(圖1B)?；蚺c5-FU藥物敏感性之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析表明，高PRKAA2表達(dá)與5-FU耐藥性呈正相關(guān)（圖1C）。Kaplan–Meier結(jié)果顯示，與PRKAA2低表達(dá)患者相比，只有PRKAA2高表達(dá)患者的生存期更差（圖1D）。我們中心的隨訪數(shù)據(jù)也有類似的結(jié)果（圖1E）。qRT PCR分析顯示，PRKAA2在5-FU耐藥組織中表達(dá)上調(diào)（圖1F）。細(xì)胞活力分析還證實(shí)，PRKAA2表達(dá)降低促進(jìn)了化療耐藥細(xì)胞的化療敏感性（圖1G）?；诔醪綐?gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們進(jìn)行了miRNA第二代測序，以進(jìn)一步優(yōu)化ceRNA網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測和測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了幾個與mRNA相關(guān)的miRNA，包括hsa-miR-21-3p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-162-5p、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-31-5p。然后，我們選擇了五個可能調(diào)控PRKAA2的候選circRNAs。qRT PCR結(jié)果顯示，在5-FU耐藥組織中，circ0027497表達(dá)（在本研究中也稱為circCPM）上調(diào)（圖1H）。隨訪數(shù)據(jù)分析顯示，只有高表達(dá)的circCPM與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)（圖1I）。細(xì)胞活力分析顯示，在5-FU耐藥的GC細(xì)胞中，circCPM表達(dá)降低，IC50降低（圖1J）。線性相關(guān)模式分析表明PRKAA2表達(dá)和circCPM表達(dá)之間存在正相關(guān)性（圖1K）。在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，有一個miR-21-3p連接circCPM和PRKAA2。因此，我們最終選擇circCPM-miR-21-3p-PRKAA2軸進(jìn)行后續(xù)研究。

2）circCPM的特征

CircCPM起源于羧肽酶M（CPM）基因的第四、第五和第六外顯子。Sanger測序確定了具有預(yù)期大小的circCPM的頭-尾剪接結(jié)構(gòu)（圖2A）。放線菌素D分析顯示，circCPM表達(dá)不受影響，而線性CPM mRNA表達(dá)降低（圖2B，C）。與線性CPM mRNA相比，circCPM對RNase R的抗性更強(qiáng)（圖2D）。接下來，為了測試circCPM的圓形結(jié)構(gòu)，我們設(shè)計(jì)了發(fā)散引物和收斂引物來擴(kuò)增circCPM和線性CPM mRNA。從AGS-5FU和HGC-27-5FU中提取的互補(bǔ)DNA（cDNA）和gDNA用作模板（圖2E，F）。結(jié)果表明，發(fā)散引物只能擴(kuò)增cDNA中的circCPM。qRT PCR結(jié)果顯示，circCPM主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖2G）。FISH結(jié)果顯示了類似的結(jié)果（圖2H）?？偟膩碚f，我們的結(jié)果表明，circCPM是一種穩(wěn)定的、來源于CPM的細(xì)胞質(zhì)circRNA，它可能在5-FU抗性中發(fā)揮重要作用。

3）CircCPM增強(qiáng)GC 5-FU體外抗藥性和自噬作用

為了確定circCPM在GC化療耐藥中的生物學(xué)功能，我們分別在5-FU敏感和耐藥細(xì)胞中構(gòu)建了circCPM過表達(dá)細(xì)胞和circCPM敲除細(xì)胞。細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示，circCPM表達(dá)的降低促進(jìn)了5-FU耐藥GC細(xì)胞的化療敏感性，IC50值降低（圖1J）。然而，在5-FU敏感GC中過表達(dá)circCPM導(dǎo)致了相反的結(jié)果（圖3A）。此外，還檢測了平板集落形成和細(xì)胞凋亡。自噬抑制劑氯喹（CQ）也應(yīng)用于這些功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在5-FU耐藥細(xì)胞中，降低circCPM表達(dá)會減少平板菌落數(shù)量并增加凋亡比例，而在5-FU敏感細(xì)胞中提高circCPM表達(dá)會導(dǎo)致相反的結(jié)果（圖3B、C）。然后，我們進(jìn)一步探討了circCPM在自噬中的潛在作用。根據(jù)LC3和p62水平測定，circCPM的沉默和過表達(dá)分別抑制并促進(jìn)5-FU耐藥和敏感細(xì)胞的基本自噬水平（圖3E）。此外，在5-FU敏感細(xì)胞中過表達(dá)circCPM后，LC3點(diǎn)的數(shù)量增加，而在5-FU耐藥細(xì)胞中沉默circCPM后，LC3點(diǎn)的數(shù)量減少（圖3D、G、H）。TEM結(jié)果證實(shí)，沉默CIRCPM導(dǎo)致A V計(jì)數(shù)減少。在5-FU敏感細(xì)胞中外源性表達(dá)circCPM觀察到相反的結(jié)果（圖3F，I，J）。

4）CircCPM在GC中起到miR-21-3p海綿的作用

眾所周知，CircRNA對miRNA有海綿的作用，circCPM主要富集在細(xì)胞質(zhì)中。因此，我們研究了circCPM與miRNA結(jié)合的可能性。通過TargetScan預(yù)測CircCPM可能與miR-21-3p結(jié)合（圖4A）。為了直接確認(rèn)circCPM與miR-21-3p結(jié)合，我們根據(jù)預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了野生型和突變型熒光素酶質(zhì)粒。熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染Luc-circCPM-WT質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，miR-21-3p極大地降低了熒光素酶活性（圖4B）。miRNA下拉分析顯示，生物素化的miR-21-3p在AGS-5FU和HGC-27-5FU細(xì)胞中顯著富集circCPM（圖4C）。通過形成circRNA- AGO2 -miRNA復(fù)合物，circRNA被證明對miRNA具有海綿的作用。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)AGO2同時(shí)與circCPM和miR-21-3p結(jié)合(圖4D,E)。隨后，FISH分析顯示circCPM和miR-21-3p共同定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4F）。為了研究circCPM和miR-21-3p在自噬和化療耐藥中的潛在機(jī)制，在GC細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。將circCPM siRNA和miR-21-3p抑制劑轉(zhuǎn)染5-FU耐藥細(xì)胞。凋亡檢測表明，circCPM siRNA顯著提高了細(xì)胞凋亡率，與miR-21-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率降低（圖4H）。凋亡相關(guān)蛋白caspase3和c-caspase3的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果（圖4G）。在轉(zhuǎn)染circCPM質(zhì)粒和miR-21-3p模擬物的5-FU敏感細(xì)胞中觀察到相反的結(jié)果，無論是否經(jīng)過CQ處理（圖4I、J、N）。此外，western blotting結(jié)果顯示circCPM siRNA明顯抑制LC3的表達(dá)水平；然而，當(dāng)與miR21-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，LC3在5-FU耐藥細(xì)胞中的低表達(dá)水平得以挽救。另一個自噬標(biāo)記物p62顯示出相反的結(jié)果（圖4K）。在用miR-21-3p模擬物和circCPM過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的5-FU敏感細(xì)胞中觀察到相反的效果，無論是否經(jīng)過CQ處理（圖4M）。此外，我們發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR21-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)了沉默circCPM降低自噬水平的效果（圖4L，O），而miR-21-3p模擬物和circCPM過表達(dá)載體的聯(lián)合轉(zhuǎn)染部分恢復(fù)了在5-FU敏感細(xì)胞中過表達(dá)circCPM的效果，無論是否進(jìn)行CQ處理（圖4P、Q）。TEM分析結(jié)果相似（圖4R）?？傊?，上述結(jié)果表明，circCPM通過miR-213p調(diào)節(jié)GC自噬和化療耐藥性。

5）MiR-21-3p通過靶向PRKAA2調(diào)節(jié)自噬和化療耐藥性

據(jù)報(bào)道，PRKAA2參與調(diào)節(jié)自噬，是耐藥性的重要原因。因此，我們假設(shè)PRKAA2可能參與5-FU耐藥性的形成。miR-21-3p的PRKKA2的潛在結(jié)合位點(diǎn)為5′UGGUGUU3’（圖5A）。接下來，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告分析。與PRKAA2 3′UTR mut相比，將PRKAA2 3′UTR wt與miR-21-3p表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可降低熒光素酶活性，這表明miR-21-3p與PRKAA2直接結(jié)合（圖5B）。Western blotting進(jìn)一步證實(shí)PRKAA2表達(dá)受miR-21-3p轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（圖5C，D）。隨后，FACS和western blotting分析顯示，miR-21-3p模擬物誘導(dǎo)5-FU耐藥細(xì)胞凋亡。然而，PRKAA2過表達(dá)載體和miR21-3p模擬物的共轉(zhuǎn)染消除了這些效應(yīng)（圖5E、G、I）。在5-FU敏感細(xì)胞中觀察到相反的結(jié)果（圖5F、H、J）。自噬水平通過miR-21-3p的過表達(dá)而降低，而通過PRKAA2在化療耐藥細(xì)胞中的過表達(dá)而得以挽救（圖5K、M）。在化學(xué)敏感細(xì)胞中觀察到相反的結(jié)果（圖5L，N）。總之，miR-21-3p通過靶向PRKAA2調(diào)節(jié)GC自噬和化療耐藥性。

6）CircRNA通過PRKAA2介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)GC的耐藥性

我們進(jìn)一步探討了circCPM和PRKAA2之間的關(guān)系。首先，FACS和Western Blot顯示，過表達(dá)PRKAA2可以減弱circCPM siRNA誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞增加（圖6A、C、D）。類似地，自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)、共焦免疫熒光和TEM分析均表明，在沉默circCPM的基礎(chǔ)上通過增強(qiáng)PRKAA2表達(dá)恢復(fù)自噬（圖6G、I、L、N）。通過共轉(zhuǎn)染circCPM質(zhì)粒和sh-PRKAA2，在5-FU敏感細(xì)胞中進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，sh-PRKAA2可以挽救circCPM過表達(dá)引起的凋亡水平下降和自噬增加（圖6B、D-F、H、J、K、M、N）?？傊?，circCPM通過PRKAA2介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)GC的化療耐藥性。

7）CircCPM增強(qiáng)體內(nèi)5-FU耐藥性

為了進(jìn)一步評估circCPM的臨床價(jià)值，將沉默或過表達(dá)circCPM的細(xì)胞與化療藥物一起皮下注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)，并使其增殖4周。分別對腫瘤進(jìn)行稱重和測量。結(jié)果表明，在5-FU耐藥細(xì)胞中沉默circCPM可顯著降低異種移植瘤的重量和體積，并增強(qiáng)5-FU治療GC的效果，而過表達(dá)circCPM則顯示相反的結(jié)果（圖7A，B）。FISH顯示circCPM和miR-21-3p共定位于5-FU耐藥或5-FU敏感GC患者的組織中。FISH分析顯示，抗5-FU的GC組織中circCPM的表達(dá)更高（圖7C）。與對照組相比，IHC觀察到轉(zhuǎn)染sh-circCPM聯(lián)合5-FU化療的腫瘤中c-caspase3蛋白水平升高，而PRKAA2顯示出相反的結(jié)果（圖7D）。我們還建立了一個類器官模型來觀察5-FU的化療敏感性。細(xì)胞活力分析表明，轉(zhuǎn)染circCPM siRNA的類器官具有較低的細(xì)胞活性。形態(tài)學(xué)上，有反應(yīng)的類器官變暗并分解（圖7E）?？偟膩碚f，circCPM在體內(nèi)促進(jìn)了GC 5-FU的耐藥性。

結(jié)論：CircularCPM通過激活PRKAA2介導(dǎo)的自噬促進(jìn)胃癌化療耐藥。circCPM可能是5-FU耐藥的生物標(biāo)志物，也是克服GC耐藥的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Fang L, Lv J, Xuan Z, Li B, Li Z, He Z, Li F, Xu J, Wang S, Xia Y, Jiang T, Zhang L, Wang L, Zhang D, Xu H, Yang L, Xu Z, Wang W. Circular CPM promotes chemoresistance of gastric cancer via activating PRKAA2-mediated autophagy. Clin Transl Med. 2022 Jan;12(1):e708. doi: 10.1002/ctm2.708.