腫瘤芽來源的CCL5招募成纖維細胞，通過CCR5-SLC25A24信號通路促進結直腸癌進展

腫瘤出芽在結直腸癌（CRC）的常規(guī)診斷中，被認為是獨立于TNM分期的腫瘤預后因素。近日，有研究發(fā)現(xiàn)：在結直腸癌（CRC）的侵襲前沿，腫瘤芽源性趨化因子配體5（CCL5）可以通過CCR5 SLC25A24信號招募成纖維細胞，通過招募的成纖維細胞進一步促進血管生成和膠原合成，最終形成促腫瘤微環(huán)境（TME）。因此，CCL5可能成為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標志物和治療靶點。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術路線：

主要研究結果：

1. CRC腫瘤細胞可將成纖維細胞招募到腫瘤芽中

作者使用H&E染色對195個臨床CRC組織樣本進行評估，結果顯示，CRC癌組織浸潤前沿的腫瘤出芽比未出芽的其他腫瘤部位有更多的成纖維細胞（圖1a）。腫瘤芽周圍的成纖維細胞顯示出α-SMA和CD90的高表達，但FAP的低表達（α-SMA^high CD90 ^high FAP^low）（圖1b）。這些結果表明，CRC組織浸潤前沿的腫瘤出芽與成纖維細胞異質性密切相關。作者又通過檢測上皮標記物E-cadherin、成纖維細胞標記物vimentin和α-SMA來鑒定成纖維細胞（圖1c）。

通過共培養(yǎng)招募試驗，發(fā)現(xiàn)FHC（人正常結直腸上皮細胞系）和LS174T、RKO、DLD-1、Caco2（人CRC細胞系）具有較弱的招募成纖維細胞的能力。相比之下，HCT-8、HCT116、HCT-15和SW620（人CRC細胞株）表現(xiàn)出更強的招募能力（圖1d和e）。由于HCT116細胞在體外表現(xiàn)出強大的招募成纖維細胞的能力，被用于進一步的活體原位CRC異種移植小鼠實驗。使用H&E染色檢查小鼠盲腸中的腫瘤，觀察到HCT116也可以在體內招募成纖維細胞（圖1f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CRC的腫瘤芽可以招募成纖維細胞。

圖1結直腸癌腫瘤細胞可將成纖維細胞招募到腫瘤芽中

2. 腫瘤芽中的CRC腫瘤細胞通過CCL5招募成纖維細胞

為了進一步確定結直腸癌腫瘤細胞分泌的關鍵細胞因子是導致成纖維細胞募集的原因，使用人類細胞因子陣列進行分析（圖2a）。GO功能富集分析表明，差異表達的蛋白質參與各種活動（圖2b）。這表明，CRC腫瘤細胞分泌的細胞因子可以招募TME中的其他細胞，并可能參與招募成纖維細胞，而成纖維細胞是細胞外基質的主要來源。

在差異表達的蛋白中，CCL5在人類CRC腫瘤細胞的CM樣本中表達最多（圖2c）。在FHC和8個人CRC腫瘤細胞株中檢測CCL5的mRNA和分泌蛋白水平，結果與共培養(yǎng)招募試驗的初步結果完全一致（圖2d, e）。此外，CCD-18Co和人類原代正常結直腸成纖維細胞分泌的CCL5水平低于FHC（圖2f）。因此，CCL5介導的成纖維細胞的招募似乎是通過旁分泌而不是自分泌信號發(fā)生的。接下來，用免疫組化法檢測人CRC組織中CCL5的表達，結果顯示CCL5在侵襲前部的腫瘤芽中高表達（圖2g）。為了檢驗CCL5是否為成纖維細胞招募的關鍵細胞因子，再次進行招募實驗（圖2h）。CCL5可以招募到CCD-18Co和不同的人類原代正常結直腸成纖維細胞（圖2i）。最后，為了確定招募成纖維細胞的CCL5是否由CRC腫瘤細胞分泌，分別用siRNA和慢病毒構建了CCL5敲除和過表達的細胞系。共培養(yǎng)招募實驗（圖2j）顯示，敲除CCL5后，腫瘤細胞招募成纖維細胞的能力明顯減弱（圖2k）。相比之下，當CCL5過表達時，這種能力增強（圖2l）。招募分析，CM樣本穩(wěn)定細胞（圖2m）顯示效果類似于觀察整個細胞（圖2 n, o）。這些結果表明CCL5在CRC腫瘤芽中高度表達，并能從TME招募成纖維細胞。

圖2腫瘤芽中的CRC腫瘤細胞通過CCL5募集成纖維細胞

3. CCL5通過CCR5受體招募成纖維細胞

為了探究CCL5是否通過它的受體介導成纖維細胞的招募，使用siRNA分別下調它們在成纖維細胞中的表達，并驗證了干擾效率（圖3a, b）。接下來，進行招募檢測，如圖3c所示：只有在成纖維細胞中下調CCR5才能顯著減弱CCL5招募成纖維細胞的能力（圖3d）。

此外，在共培養(yǎng)招募試驗之前和期間，分別使用CCR1抑制劑BX471和CCR5抑制劑Maraviroc治療成纖維細胞，并阻斷CCR1和CCR5（圖3e）。只有Maraviroc治療顯著削弱了CCL5招募成纖維細胞的能力（圖3f）。以上結果強烈表明CCL5通過CCR5受體參與成纖維細胞招募。

圖3 CCL5通過CCR5受體招募成纖維細胞

4. 在成纖維細胞中，SLC25A24介導CCL5依賴的成纖維細胞補充

為了探究CCL5刺激后成纖維細胞的胞內變化，使用CCL5治療前后的成纖維細胞進行了轉錄組測序（圖4a）。選取差異表達前20個基因進行驗證：在CCL5治療后，SLC25A24 mRNA水平在人類原代正常結直腸成纖維細胞中上調（圖4b）。

采用IF法檢測SLC25A24蛋白在人結直腸癌組織中的表達和定位。結果顯示，SLC25A24在侵襲前部腫瘤芽周圍的成纖維細胞中高度表達（圖4c）。在體內，在sh-CCL5轉染的CRC細胞的腫瘤異種移植中，觀察到成纖維細胞中SLC25A24的表達減少（圖4d）。

功能上，為了探索CCL5介導的成纖維細胞招募是否依賴于SLC25A24，將抗SLC25A24的siRNA轉染成纖維細胞，并進行招募實驗（圖4e）。成纖維細胞中SLC25A24表達的減少顯著削弱了CCL5招募成纖維細胞的能力（圖4f, g）。這表明CCL5介導的成纖維細胞招募依賴于SLC25A24和CCR5。

KEGG富集分析表示PI3K-Akt信號通路在CCL5刺激后最為活躍（圖4h）。免疫印跡結果顯示，CCL5可以促進成纖維細胞Akt和mTOR的磷酸化（圖4i，左圖）。相比之下，當SLC25A24的表達被抑制時，CCL5刺激后成纖維細胞磷酸化的Akt和mTOR水平下降（圖4i，右圖）。這些發(fā)現(xiàn)表明CCL5通過成纖維細胞中的SLC25A24- pAkt-pmTOR軸招募成纖維細胞。

圖4成纖維細胞中SLC25A24介導CCL5依賴性成纖維細胞補充

5. CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細胞，從而促進腫瘤血管生成

最初發(fā)現(xiàn)（圖1b）證明腫瘤芽周圍的成纖維細胞是α-SMA^high, CD90^high和FAP^low。為了檢驗CCL5是否是增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細胞的主要原因，進行了IF試驗。該實驗表明，經(jīng)CCL5處理的成纖維細胞中α-SMA和CD90的表達升高（圖5a）。下一步研究CCL5在成纖維細胞介導的血管生成中的作用。免疫印跡顯示CCL5處理后成纖維細胞血管內皮標志物FLI1、VE-cadherin、CD31、VEGFA水平以及α-SMA和CD90水平升高（圖5b）。流式細胞術也顯示，在CCL5刺激后，VE-cadherin⁺成纖維細胞亞群的比例增加（圖5c）。CCL5刺激后增強成纖維細胞的促血管生成能力（圖5d）。在侵襲性前沿，CCL5在腫瘤芽中高表達，腫瘤芽被大量的α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細胞和血管包圍（圖5e）。綜上，腫瘤芽源CCL5增加了α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細胞的數(shù)量，并通過增加VEGFA和成纖維細胞轉分化為血管內皮細胞來促進腫瘤血管生成。

圖5 CCL5有助于增加α-SMA^high CD90^high FAP^low成纖維細胞，從而促進腫瘤血管生成

6. CCL5通過成纖維細胞促進膠原合成，促進腫瘤進展

GO功能富集分析表明，CCL5也參與細胞外基質相關功能（圖6a）。WB分析顯示CCL5可以增加體外成纖維細胞中COL1和COL3的蛋白表達（圖6b）。臨床樣本中，CRC組織中CCL5的表達明顯高于正常組織（圖6c）。采用Pearson’s^χ2檢驗分析CCL5表達與臨床特征之間的相關性（表1）。進一步的Spearman相關性試驗表明，CCL5高水平表達與腫瘤芽增加的高風險（圖6 d）呈正相關。此外，對195例人結直腸癌組織標本中的88例進行了COL1和COL3染色，以檢測膠原分布。結果顯示結腸結直腸癌組織中COL1和COL3表達升高（圖6e）。采用Pearson’s^χ2檢驗分析Sirius Red染色與CRC臨床特征的相關性（表2）。進一步的Spearman相關性檢驗顯示，CRC腫瘤細胞周圍膠原蛋白的高分布與腫瘤芽的增加呈正相關（圖6f）。CCL5在侵襲性前緣腫瘤芽中的高表達往往伴隨著膠原合成的增加（圖6g）。Spearman相關性分析顯示，同一CRC組織樣本中，腫瘤細胞中CCL5的表達水平與周圍膠原蛋白的數(shù)量呈正相關（圖6h）。

隨后，利用分泌大量CCL5的HCT116細胞建立原位CRC異種移植小鼠模型進行體內分析。發(fā)現(xiàn)侵襲性前沿的腫瘤細胞周圍膠原合成增加（圖6i）。利用人CRC基因芯片圖譜GSE39582分析COL1或COL3低表達和高表達患者的無復發(fā)生存期：COL1和COL3的高表達與CRC患者預后不良密切相關（圖6j）。綜上所述，腫瘤芽分泌CCL5，然后通過成纖維細胞促進膠原合成，從而促進腫瘤進展。

圖6 CCL5通過成纖維細胞促進膠原合成，促進腫瘤進展

主要結論：

本研究發(fā)現(xiàn)CRC腫瘤芽分泌高水平的CCL5，CCL5通過CCR5- SLC25A24信號征集成纖維細胞，導致侵襲前沿腫瘤芽周圍形成特征性成纖維細胞簇。這進一步促進了腫瘤血管生成和膠原合成，促進了惡性進展（圖6k）。因此，該研究為CCL5可能作為CRC腫瘤出芽的潛在診斷標志物和治療靶點提供了證據(jù)。

參考文獻：

Gao LF, Zhong Y, Long T, Wang X, Zhu JX, Wang XY, Hu ZY, Li ZG. Tumor bud-derived CCL5 recruits fibroblasts and promotes colorectal cancer progression via CCR5-SLC25A24 signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41:81.