單細(xì)胞測(cè)序分析挖掘心球衍生細(xì)胞的起源和特性

從人類心臟活組織中產(chǎn)生的心球衍生細(xì)胞（CDCs）在臨床試驗(yàn)中已被證明具有疾病修飾的生物活性。矛盾的是，CDCs在心臟的細(xì)胞起源仍然難以捉摸。本研究使用單細(xì)胞RNA測(cè)序(sc-RNAseq)研究了CDCs與心臟非肌細(xì)胞和非造血細(xì)胞(心臟成纖維細(xì)胞/CFs、平滑肌細(xì)胞/SMCs和內(nèi)皮細(xì)胞/ECs)的分子特性?？傊?，CDCs是一種富含線粒體的細(xì)胞，具有獨(dú)特的特性，但也與右心房CFs相似。CDCs表現(xiàn)出高度增殖、分泌和免疫調(diào)節(jié)的特性，這些特性也可在活化或炎癥細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)。通過特殊的培養(yǎng)條件，CDCs獲得一些生物活性，包括血管生成潛力，這可以改變某些疾病的異常。 本研究于2022年3月發(fā)表在《Basic Research in Cardiology》IF：17.165雜志上。

技術(shù)路線如下：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、成人CDCs的特征與其他原發(fā)性非肌細(xì)胞類型相比

CDCs分離自接受心臟手術(shù)的成人右心耳組織，并通過包括生長(zhǎng)因子刺激在內(nèi)的“3D心球”建立的(Fig. 1A)。為了評(píng)估CDCs不同的分子譜，將其與心臟成纖維細(xì)胞(CFs)、平滑肌細(xì)胞(SMCs)、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和脂肪組織來源成纖維細(xì)胞(AFs)等非心臟細(xì)胞類型進(jìn)行比較。分別從心臟脂肪組織和皮下脂肪組織中分離出CFs和AFs(Fig. 1A)。冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)患者的胸廓血管生成ECs和SMCs(Fig. 1A)。

首先qRT-PCR檢測(cè)了這些細(xì)胞類型的表面標(biāo)志物以驗(yàn)證是否分離正確（Fig. 1B–F）。隨后免疫細(xì)胞化學(xué)染色或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)選定標(biāo)志物的蛋白水平(Fig. 1G–L)。總之，這些結(jié)果表明CDCs表現(xiàn)出與非肌細(xì)胞類型相似的分子特征。然而，CDCs明顯不同于真正的心臟祖細(xì)胞(DIFF D6)和未成熟的心肌細(xì)胞(DIFF D8)。描述良好的CDCs標(biāo)記物，如CD105，在AFs、CF、SMCs和ECs中均有表達(dá)。

圖1與其他原發(fā)性非肌細(xì)胞類型相比，成人CDC的特征

2、CDCs的單細(xì)胞RNA測(cè)序與主要的心臟非肌細(xì)胞類型進(jìn)行比較

對(duì)CDCs細(xì)胞，和3中主要的心臟非肌細(xì)胞CF、SMCs和ECs進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。圖2A根據(jù)細(xì)胞標(biāo)識(shí)描述了細(xì)胞類型。對(duì)于CDCs，CF、SMCs和ECs，鑒定了上調(diào)的前10個(gè)基因(Fig. 2B)。CFs、SMCs、ECs和CDCs的無(wú)監(jiān)督全局聚類根據(jù)其特定的基因表達(dá)將其細(xì)分為11個(gè)不同的聚類，從視覺上看，所有細(xì)胞類型都分裂成兩個(gè)主要的簇，有時(shí)還會(huì)有進(jìn)一步的亞簇，特別是對(duì)于CDCs來說，分為了5個(gè)亞簇(Fig. 2C)。為了更好地了解CDCs，研究了五個(gè)CDsC亞簇集群的GSEA。所有的細(xì)胞群都表現(xiàn)出主要的免疫調(diào)節(jié)特性，如“對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)” (Fig. 2D)。主要集群Cl4/7/3和Cl5/8兩者之間的主要區(qū)別CDCs的Cl5/8似乎參與更有活力過程（線粒體，細(xì)胞呼吸，F(xiàn)ig. 2D）。為了更好地了解CDCs與CFs、ECs或SMCs之間是否存在顯著的相似性，計(jì)算細(xì)胞相似性。在CDCs的樣本中出現(xiàn)了三個(gè)峰，其中，峰值明顯，第二峰值與CFs和SMCs相似度得分大致相同，最小峰值與SMC曲線的小峰平行(Fig. 2E)。到目前為止，sc-RNAseq結(jié)果顯示CDCs表現(xiàn)出最多的線粒體基因，并以分泌和免疫調(diào)節(jié)特征區(qū)別于CFs、SMCs和ECs。然而，CDCs也顯示出與非肌細(xì)胞類型的某些相似之處。

3、CDCs的單細(xì)胞RNA測(cè)序與分化的hESCs進(jìn)行比較

為了更詳細(xì)地比較CDCs與真正的心臟祖細(xì)胞(CPCs)和早期心肌細(xì)胞(CMs)，納入了分化的人ESCs (hESCs)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以在hESC分化過程中繪制譜系決定的軌跡圖。hESC DIFF D6/D7/D8/D9/D15進(jìn)行整合并生成UMAP圖(Fig. 2F, G)。無(wú)監(jiān)督聚類產(chǎn)生了8個(gè)聚類(Fig. 2G)。CDCs與CPCs或TBX5、GATA4和NKX2-5明顯標(biāo)記的早期CMs無(wú)重疊(Fig. 2F-H)。此外，CDCs與上皮細(xì)胞(群集5)或血管生成祖細(xì)胞(群集7)沒有重疊(Fig. 2F, G)。然而，CDCs在簇中與分化的hESCs重疊，顯示CF- (cluster 2)或增殖細(xì)胞(cluster 0,6)的特征(Fig. 2F, G)。有趣的是，早期定義的CDCs標(biāo)志物如CXCL1、CXCL6和IL1B(圖2B)在這種情況下對(duì)CDCs具有高度特異性(Fig. 2I)。綜上所述，通過比較CDCs和分化的hESCs的sc-RNAseq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其與心臟祖細(xì)胞或早期心肌細(xì)胞沒有重疊。

圖2CDCs的單細(xì)胞RNA測(cè)序與主要的心臟非肌細(xì)胞類型(CFs、SMCs、ECs)和分化的hESCs進(jìn)行比較。

4、sc-RNAseq對(duì)CDCs和右心房活檢的比較

接下來，試圖闡明CDCs在成人心臟中的起源細(xì)胞群。因此，使用來自四個(gè)不同個(gè)體的右心房人活組織切片，并進(jìn)行了單核(RA-1, RA-2)或單細(xì)胞(RA-3，單核(sn) RNAseq數(shù)據(jù)。心肌細(xì)胞(CMs) 單核(sn) RNAseq數(shù)據(jù)用的是前人的研究。將Sn-和sc-RNAseq活檢數(shù)據(jù)與成人CDC sc-RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，生成UMAP圖。首先，單細(xì)胞和單細(xì)胞核很好地聚集在一起，因此能夠在四個(gè)活檢樣本中識(shí)別所有主要的心臟細(xì)胞類型:CMs、CFs、ECs、SMCs/周細(xì)胞(PCs)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(MPs)和B-/ t細(xì)胞(Fig. 3A–C)。新的CDCs標(biāo)志物CXCL1/6/8和IL1B(圖2B)也在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)(CXCL6除外)( Fig. 3C)。有趣的是，CDCs位于CFs附近(Fig. 3A、B)。77%的CDCs甚至共享CF-1集群。23%的CDCs建立了自己的集群(Cl7: CDC-2)。與CF相比，CMs離CDCs較遠(yuǎn)，EC和周細(xì)胞/SMCs離CDCs更遠(yuǎn)。

因此，推測(cè)CDCs可能是CF細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，試圖使用單細(xì)胞軌跡分析。在CDCs的兩個(gè)集群中(Cl7: CDC和Cl2: CF-1/CDC)，檢測(cè)到三個(gè)軌跡分支(編號(hào)為1、2和3) (Fig. 3D)。CDCs和CFs建立了三個(gè)主要的軌跡，其中cdc在偽空間的一端，CFs在另一端。為了了解其軌跡分支，研究了相關(guān)基因。為此，作者在Seurat中進(jìn)行了額外的亞群分析，并分析了聚類0(映射到軌跡1)、7(映射到軌跡2)和12(映射到軌跡3)中的前25個(gè)特定基因(Fig. 3E)。GSEA表明，軌跡1主要與External encapsulating structure和ECM organization有關(guān)。軌跡2與locomotion and development有關(guān)。軌跡3，CDCs軌跡，與response to cytokine，immune system processes，secretion有關(guān)。

圖3 sc-/sn- RNAseq對(duì)CDC和人心房活檢的比較。

5、成人與嬰兒CDCs的分子特征比較

對(duì)來自新生兒或成人心房的人心肌細(xì)胞的再臨床研究表明，在免疫缺陷梗死大鼠心臟移植后，新生兒心肌細(xì)胞比成人心肌細(xì)胞具有更強(qiáng)的修復(fù)能力。新生兒CDCs維持心肌功能，防止不良重塑，促進(jìn)血管生成。所以作者試圖闡明成人與嬰兒CDCs的分子特征的區(qū)別。有趣的是，基因表達(dá)分析顯示，與成人CDCs和嬰兒CFs相比，嬰兒CFs中心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA4和TBX5的表達(dá)較低(Fig. 4A)。相比之下，NKX2-5在嬰兒組(CDCs和CFs)的表達(dá)顯著升高。CF標(biāo)記物ALDH1A2在兩個(gè)年齡組中與嬰兒細(xì)胞相比在成人細(xì)胞中上調(diào)，與CDCs相比在CF中上調(diào)，S100A4在兩個(gè)年齡組中，與CFs比較，都是在CDCs中上調(diào)，THY1 (CD90)也是如此(Fig. 4B)。CXCL6在兩個(gè)年齡組的CDCs中均具有特異性，而miR-146a僅在嬰兒組中與CFs相比在CDCs中具有特異性(Fig. 4C)。兩個(gè)CDCs樣本(嬰兒和成人，圖4D)的無(wú)監(jiān)督全局聚類，根據(jù)其特定的基因表達(dá)將CDCs細(xì)分為6個(gè)聚類(Fig. 4E)。在嬰兒和成人樣本之間主要有兩組(0,3)重疊(Fig. 4F)。通過計(jì)算細(xì)胞相似性，證實(shí)了嬰兒和成人CDCs樣本具有較高的相似性(Fig. 4G)。有趣的是，GSEA揭示了兩個(gè)集群的具有幾個(gè)相似的GO分類(Fig. 4H)。這些結(jié)果sc-RNAseq分析顯示新生兒CDCs參與心臟發(fā)育過程，而成人CDCs更多地參與免疫調(diào)節(jié)和分泌。

圖4成人與嬰兒CDCs的分子特征比較。

6、CDCs和CF來源的細(xì)胞外囊泡（EV）介導(dǎo)的旁分泌效應(yīng)

分析CDCs的旁分泌作用，如促進(jìn)血管生成和抗纖維化作用或抑制心肌細(xì)胞凋亡。將不同細(xì)胞來源的EV和不同類型的心肌細(xì)胞共孵育，檢測(cè)心肌細(xì)胞的管腔形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CF-EV比較，CDC-EV顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞血管生成和運(yùn)動(dòng)能力（Fig. 5A–I）。

圖5 CDC和CF來源的細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的旁分泌效應(yīng)。

綜上所述，本研究對(duì)培養(yǎng)的人原代細(xì)胞(CF、SMCs、ECs和CDCs)進(jìn)行Sc-RNAseq分析，揭示了其分子特性的詳細(xì)圖像。CDCs是一種線粒體豐富的細(xì)胞類型(線粒體基因含量高)，與CFs、SMCs和ECs的區(qū)別主要在于其分泌和免疫調(diào)節(jié)特性(Fig. 6)。

圖6 CDCs的分子鑒定

參考文獻(xiàn)：

Kogan, PS., Wirth, F., Tomar, A. et al. Uncovering the molecular identity of cardiosphere-derived cells (CDCs) by single-cell RNA sequencing. Basic Res Cardiol 117, 11 (2022). https://doi-org.blk.80599.net/10.1007/s00395-022-00913-y