抑制線粒體蛋白OPA1可抑制乳腺癌的生長(zhǎng)

線粒體融合和裂變蛋白已被提名為癌癥的藥物靶點(diǎn)。而由于三陰性乳腺癌（TNBC）幾乎總是發(fā)生化療耐藥性，它們的抑制作用對(duì)TNBC是否有效尚不清楚。目前，有研究發(fā)現(xiàn)靶向抑制線粒體融合蛋白OPA1可抑制TNBC的生長(zhǎng)，并將OPA1指定為TNBC中的藥物靶點(diǎn)。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.乳腺癌中OPA1水平升高與預(yù)后差有關(guān)

作者首先在TNMplot數(shù)據(jù)庫中比較了OPA1, MFN1和MFN2在健康組織和腫瘤組織中的表達(dá)。分析表明，在融合基因中，OPA1在AML、乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睪丸和子宮癌組織中顯著過度表達(dá)（圖1a）。同樣， OPA1 mRNA在乳腺癌中上調(diào)（圖1b），不同乳腺癌亞型之間沒有任何差異（圖1c），而MFN1和MFN2差異不明顯。另外，OPA1水平越高，乳腺癌預(yù)后越差（圖1d），MFN1表達(dá)水平也與較差的預(yù)后相關(guān)，而MFN2表達(dá)水平與預(yù)后無關(guān)。這些分析表明，在乳腺癌中，當(dāng)這兩個(gè)線粒體融合基因水平降低時(shí)，OPA1和MFN1上調(diào)，預(yù)后更差，而MFN2水平降低，但與不同的預(yù)后無關(guān)。

圖1 OPA1在乳腺組織中過表達(dá)

2.OPA1是乳腺癌細(xì)胞多種癌癥特征所必需的

鑒于MFNs的水平與較差的乳腺癌預(yù)后有明確的關(guān)聯(lián)，作者選擇研究OPA1在乳腺癌中的作用上。作者選OPA1兩種不同的siRNA研究對(duì)MDA-MB-231影響（圖2a，b），發(fā)現(xiàn)siRNA-OPA1減少了MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力（圖2c-f），降低了細(xì)胞增殖（圖2g）、侵襲（圖2h-i）和纖維連接蛋白的粘附（圖2j），而不影響細(xì)胞在明膠上的粘附（圖2k），且CrispR/ Cas9生成的MDA-MB-231 OPA1敲除細(xì)胞株（MDA-MB-231 OPA1 -/-）也得到了驗(yàn)證。在其他乳腺癌亞型中，沉默OPA1也抑制了其他乳腺癌細(xì)胞的遷移、增殖和粘附（圖2l-q）。另外，無毒劑量的MYLS22（OPA1抑制劑）可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、增殖和粘附（圖3a-f）。這些結(jié)果表明，基因或藥理抑制OPA1可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖2 OPA1是乳腺癌細(xì)胞特征所必需的

圖3 體外研究表明，藥理抑制OPA1可以降低乳腺癌的特征

3.OPA1消融會(huì)損害乳腺癌體內(nèi)生長(zhǎng)

下一步研究TNBC細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)是否需要OPA1。將MDA-MB-231 OPA1 -/-和MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1原位植入6周齡NOD-SCID小鼠的乳腺。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有觀察到MDA-MB-231 OPA1 -/-細(xì)胞的生長(zhǎng)，和MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1的移植和生長(zhǎng)（圖4a）。為了避免植入問題，將MDA-MB-231 OPA1 -/-和MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1細(xì)胞植入母體基質(zhì)細(xì)胞 （3/8 engrafted MDA-MB-231 OPA1 -/- vs. 8/8 MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1），但由于37.5%的植入物附著，可以比較MDA-MB-231 OPA1 -/-與MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1移植物幾乎為零的腫瘤生長(zhǎng)（圖4b，c）。一段時(shí)間后，移植腫瘤并測(cè)量細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin D），與MDA-MB-231 OPA1 -/-相比，MDA-MB-231 OPA1 -/-：OPA1中幾乎沒有Cyclin D （圖4d）。此外，當(dāng)通過乳腺癌免疫染色觀察內(nèi)皮標(biāo)記物CD31的腫瘤血管時(shí)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 OPA1 -/-腫瘤中血管直徑減少而血管數(shù)量沒有減少（圖4e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，急性抑制OPA1可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，后續(xù)建立一個(gè)原則性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證急性藥物OPA1抑制是否可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。MDA-MB-231被原位植入乳腺，21天后，每隔一天通過瘤周注射10 mg/kg MYLS22進(jìn)行分娩，發(fā)現(xiàn)足以抑制MDA-MB-231腫瘤的生長(zhǎng)（圖4h-i）。因此，靶向抑制OPA1可以有效減弱體內(nèi)乳腺癌的生長(zhǎng)。

圖4 基因或藥理抑制OPA1抑制腫瘤生長(zhǎng)

4.MicroRNA圖譜鑒定了OPA1抑制后上調(diào)的miRNA

進(jìn)一步研究OPA1調(diào)控乳腺癌的分子機(jī)制。首先發(fā)現(xiàn)，基因或藥理抑制OPA1可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞線粒體破碎（圖5a-g），但在OPA1沉默和OPA1消融的MDA-MB-231細(xì)胞中，線粒體膜電位、ATP水平和線粒體呼吸沒有受到影響（圖5 h-j）。有多篇文獻(xiàn)已報(bào)道在乳腺癌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種miRNAs可以調(diào)節(jié)由OPA1缺失引起的相同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，作者通過miRCURY LNA Cancer Focus PCR Panel對(duì)miRNA進(jìn)行了分析，以研究OPA1缺失是否影響了miRNA的表達(dá)。最終發(fā)現(xiàn)對(duì)照和去除OPA1中84個(gè)miRNA中只有6個(gè)差異表達(dá)（圖6a）。結(jié)合miR-148a-3p和miR-152是上調(diào)量最高的兩個(gè)miRNAs，并屬于同一個(gè)miRNA148/152家族：MiR-148/152家族的成熟成員長(zhǎng)度為21-22個(gè)核苷酸，相同的種子序列為6-7個(gè)核苷酸（圖6b）。qPCR證實(shí)，在所有測(cè)試的乳腺癌細(xì)胞類型中，隨著OPA1下調(diào)或藥理抑制，miRNAs-148a、148b和152的水平都有所增加（圖6c-h）。在MDA-MB-231 OPA1+/+細(xì)胞中過表達(dá)OPA1時(shí)（MDA-MB-231 OPA1 OPA1+/+：OPA1），這些miRNA的水平進(jìn)一步降低（圖6i-k）?？傊?，這些結(jié)果表明，148/152家族的miRNAs水平與OPA1呈負(fù)相關(guān)。

圖5體外切除OPA1不影響乳腺癌細(xì)胞線粒體代謝

圖6 OPA1消融提高miR-148a、miR-148b和miR-152表達(dá)水平

5.148/152家族的miRNAs介導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞中OPA1下調(diào)的作用

為了確定miR-148a、148b和152過表達(dá)是否可以解釋MDA-MB-231細(xì)胞中OPA1下調(diào)的表型，首先通過miRpaths （microT-CDS）分析了這三種miRNAs表達(dá)水平變化可能干擾的信號(hào)通路和細(xì)胞功能：miR-148a、148b和152具有調(diào)控RAS和PI3K/AKT信號(hào)通路的潛能。此外，miR-148a、148b和152還可以控制細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與受體的相互作用、局灶性粘連和聚糖降解作用（圖7a）。實(shí)驗(yàn)分析表明，這些miRNA的過表達(dá)降低了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移、增殖和粘附（圖7b-d），降低了CYCLIN D2和D3, INTEGRIN-β mRNA和蛋白的水平，從而降低了ERK磷酸化（圖7e）。相反，沉默miR-148a、miR-148b或miR-152可以拯救沉默了OPA1的乳腺癌細(xì)胞的遷移、增殖和粘附（圖7f-t）。這些結(jié)果證實(shí)了148/152家族的miRNAs在乳腺癌細(xì)胞中作為OPA1沉默的媒介的作用。

圖7 OPA1消融通過增加miRNA 148a、148b和152的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的特征

結(jié)論：

總之，作者證明了OPA1在乳腺癌中高表達(dá)，而其水平與較差的預(yù)后相關(guān)。多種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制OPA1可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲性和新生血管的形成，抑制TNBC在體外和體內(nèi)的生長(zhǎng)。確定了OPA1在調(diào)節(jié)148/152家族miRNAs表達(dá)中的作用，這是OPA1在調(diào)節(jié)乳腺癌特征中的上位性作用。該研究將OPA1作為癌癥治療提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Zamberlan M, Boeckx A, Muller F, Vinelli F, Ek O, Vianello C, Coart E, Shibata K, Christian A, Grespi F, Giacomello M, Struman I, Scorrano L, Herkenne S. Inhibition of the mitochondrial protein Opa1 curtails breast cancer growth. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41:95.