microRNA-142通過控制Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能來對(duì)抗自身免疫

調(diào)節(jié)性T (T_reg)細(xì)胞在預(yù)防異常的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，microRNA (miRNA)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制已成為T_reg細(xì)胞功能的重要遺傳因素。目前，有研究發(fā)現(xiàn)miR-142作為T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)不可或缺的調(diào)節(jié)因子，通過減弱IFNγ反應(yīng)發(fā)揮其功能。該研究于2022年2月發(fā)表在《PLoS biology》，IF：8.029。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. T_reg細(xì)胞特異性miR-142缺失小鼠的致死性自身免疫疾病

作者前期發(fā)現(xiàn)miR-142在T細(xì)胞中動(dòng)態(tài)表達(dá)，其整體消融導(dǎo)致T_reg細(xì)胞特異性缺陷。為了確定miR-142在T_reg細(xì)胞功能中的作用，構(gòu)建T_reg細(xì)胞特異性消融miR-142的小鼠(Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠)。Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙：壽命短（圖1A），體型較小（圖1B），體重顯著低于野生型（WT;Foxp3^Cre）同窩小鼠（圖1C）。形態(tài)學(xué)分析顯示，Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠出現(xiàn)了系統(tǒng)性淋巴增生性自身免疫性疾病，其特征為顯著的淋巴結(jié)病(圖1D)，輕度脾腫大(圖1D)，皮炎(圖1B)，以及大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官(圖1E)。綜上所述，Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的表型結(jié)果與嚴(yán)重T_reg細(xì)胞缺陷小鼠的自身免疫病理相似，提示miR-142參與調(diào)節(jié)T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或穩(wěn)定性。

圖1 T_reg細(xì)胞特異性破壞miR-142小鼠的致命自身免疫性疾病

2. Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的Treg細(xì)胞缺損和T細(xì)胞異常激活

Foxp3^CremiR-142^fl/fl脾臟中T_reg細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖2A)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠外周血T細(xì)胞的激活狀態(tài)：與WT老鼠相比，CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的數(shù)量與內(nèi)存/效應(yīng)表型(CD44^hiCD62L^lo)明顯高于在脾臟和淋巴結(jié)Foxp3^CremiR-142^fl/fl的老鼠，而在KO動(dòng)物中，原始的(CD44^loCD62L^hi) CD4 +和CD8 + T細(xì)胞大大減少(圖2 B和2C)。此外，從Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中分離的CD4+和CD8+ T細(xì)胞都顯示出IFNγ的產(chǎn)生急劇增加(圖2D和2E)。因此，條件下敲除miR-142會(huì)損害T_reg細(xì)胞的功能，進(jìn)而導(dǎo)致T_eff反應(yīng)的嚴(yán)重失調(diào)。

圖2 miR-142是維持T_reg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受所必需的

3. miR-142對(duì)于T_reg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和抑制活性至關(guān)重要

將純化的缺失miR-142和充足miR-142的T_reg細(xì)胞與經(jīng)抗原受體刺激誘導(dǎo)增殖的WT T_conv細(xì)胞共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)與miR-142充足的T_reg細(xì)胞相比，miR-142不足的T_reg細(xì)胞表現(xiàn)出抑制活化T_conv細(xì)胞增殖的能力(圖3A)。另外，用來自C57BL/6的同種異體CD4+ T_conv細(xì)胞(H2^b)移植的BALB/c小鼠(H2^d)受到致命照射后，迅速發(fā)生亞致死aGVHD，表現(xiàn)為宿主小鼠駝背、嚴(yán)重腹瀉和體重減輕(圖3B和3C)。WT T_reg細(xì)胞與異體供體T細(xì)胞同時(shí)移植可減輕宿主小鼠的腹瀉和體重減輕(圖3C)，從而減輕aGVHD癥狀的嚴(yán)重程度。相比之下，miR-142缺失的T_reg細(xì)胞未能保護(hù)宿主小鼠免受aGVHD的發(fā)展，并可能通過加劇炎癥反應(yīng)導(dǎo)致死亡(圖3B和3C)，這表明miR-142在調(diào)節(jié)體內(nèi)T_reg細(xì)胞抑制活性中起著重要作用。此外，移植后17天，宿主小鼠脾臟中供體miR-142缺陷型T_reg細(xì)胞的頻率顯著降低（圖3D），表明miR-142缺陷型T_reg細(xì)胞的存活或體內(nèi)平衡缺陷。

為了測(cè)試miR-142消融是否影響T_reg細(xì)胞的存活，比較miR-142充分和miR-142缺乏的T_reg細(xì)胞對(duì)TCR刺激的誘導(dǎo)凋亡。發(fā)現(xiàn)純化的脾miR-142 KO T_reg細(xì)胞更容易激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（圖3E）。此外，鑲嵌小鼠脾臟YFP+miR-142缺陷型T_reg細(xì)胞的頻率顯著降低（圖3F），表明miR-142在T_reg細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮細(xì)胞自主作用。此外，BrdU體內(nèi)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，miR-142缺失的T_reg細(xì)胞的增殖能力幾乎比WT T_reg細(xì)胞低2倍(圖3G)。miR-142缺失的T_reg細(xì)胞表現(xiàn)出幾種t細(xì)胞激活標(biāo)志物的上調(diào) (圖3H)。并且在miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中，保護(hù)T_reg細(xì)胞免受凋亡的程序性死亡-1 (PD-1)受體的水平顯著降低(圖3H)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-142在調(diào)節(jié)T_reg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持和增殖中起重要作用。

圖3 miR-142消融會(huì)損害T_reg細(xì)胞的抑制功能和穩(wěn)態(tài)

4. T_reg細(xì)胞中miR-142的特異性缺失導(dǎo)致miR-142-3p靶點(diǎn)的整體抑制

為了揭示miR-142控制T_reg細(xì)胞功能的分子機(jī)制，使用RNA測(cè)序?qū)ζ?/span>CD4+YFP+ miR-142充足和miR-142缺乏的T_reg細(xì)胞進(jìn)行了整體轉(zhuǎn)錄組分析：共1520個(gè)基因在miR-142消融后表達(dá)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化，在miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中，988個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，532個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖4A)。另外，miR-142缺陷的T_reg細(xì)胞中的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-142-3p顯著富集，而miR-142-5p在上調(diào)基因中的直接靶基因中沒有顯著富集(圖4B)。提示Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能受損很可能是由于成熟miR-142-3p表達(dá)缺失所致。根據(jù)Enrichment軟件算法和基因集富集分析(GSEA) (圖4C)，miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本富集了來自IFNγ信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的基因。同樣地，miR-142缺失的T_reg細(xì)胞與WT細(xì)胞相比產(chǎn)生了更多的IFNγ(圖4D和4E)，IFNγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)，表現(xiàn)為Stat1激活顯著增加(圖4D和4E)。另外，檢測(cè)IFNγ刺激對(duì)T_reg細(xì)胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)IFNγ處理顯著增強(qiáng)了miR-142缺失的T_reg細(xì)胞的體外凋亡(圖4G和4H)。

圖4 miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中，miR-142-3p靶點(diǎn)整體去抑制和IFNγ信號(hào)異常

5. Ifng消融可挽救Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠的T_reg穩(wěn)態(tài)缺陷并緩解系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)展

為了確定IFNγ信號(hào)異常如何影響miR-142缺陷的T_reg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，構(gòu)建Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng /雙KO小鼠。在雙KO小鼠中，T_reg穩(wěn)態(tài)缺陷完全恢復(fù)(圖5A)。此外，Ifng缺失減輕了Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠系統(tǒng)性淋巴增生性和致命自身免疫性疾病的發(fā)展。這一結(jié)論在Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng /小鼠上得到支持（圖5B-F）。需要注意的是，雙KO小鼠顯示出組織炎癥減輕，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到外周組織的數(shù)量明顯減少(圖5G)。這些形態(tài)學(xué)變化與Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng/小鼠周圍naive T_conv細(xì)胞數(shù)量的適度增加相關(guān)(圖5H)，表明miR-142-IFNγ信號(hào)軸對(duì)維持T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。盡管Foxp3^CremiR-142^fl/flIfng/小鼠中T_reg細(xì)胞頻率恢復(fù)，但雙KO小鼠中剩余的CD4+ T轉(zhuǎn)換細(xì)胞過度激活暗示miR-142在調(diào)節(jié)T_reg細(xì)胞免疫抑制活性中可能發(fā)揮作用。

圖5在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，阻斷IFNγ的產(chǎn)生可以修復(fù)Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)缺陷并減輕系統(tǒng)自身免疫

6. miR-142-3p靶向多種IFNγ相關(guān)基因

在miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中，幾個(gè)與IFNγ相關(guān)的基因被TargetScan算法預(yù)測(cè)為miR-142-3p的假定直接靶點(diǎn)(圖4C)。對(duì)HITS-CLIP數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展分析顯示，缺氧誘導(dǎo)因子1 alpha (Hif1a)是miR-142-3p的潛在靶點(diǎn)(圖6A)。通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，證實(shí)了miR-142-3p通過直接結(jié)合的3'-UTR序列來減弱Hif1a和Ifnγr2表達(dá)的能力(圖6B)。同時(shí)，miR-142缺失的T_reg細(xì)胞中Hif1α和IFNγR2蛋白水平顯著升高，而CD4+T_conv細(xì)胞中Hif1α表達(dá)保持不變(圖6C)。但是在缺乏miR-142表達(dá)的T_reg細(xì)胞中，沒有觀察到Hif1a mRNA表達(dá)的變化。

圖6在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，降低Hif1a基因劑量可部分恢復(fù)T_reg群體的正常大小，并減弱外周血T細(xì)胞的過度激活

7. 在Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠中，Hif1a單倍體不足挽救了T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)缺陷

為了確定miR-142-Hif1a軸在T_reg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能中的作用，通過將Foxp3^CremiR-142^fl/fl小鼠與攜帶條件性Hif1a等位基因（Hif1a^fl/fl）的小鼠雜交，降低了miR-142缺陷型T_reg細(xì)胞中Hif1a基因的劑量，產(chǎn)生的Foxp3^CremiR-142^fl/flHif1a^+/fl小鼠顯示T_reg細(xì)胞豐度的部分恢復(fù)（圖6D）。此外，Foxp3^CremiR-142^fl/flHif1a^+/fl小鼠顯示出外圍激活/效應(yīng)CD4+ T細(xì)胞頻率的部分降低(圖6E和6F)。

結(jié)論

miR-142作為T_reg細(xì)胞發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和抑制活性的中心調(diào)節(jié)因子，部分通過限制IFNγ的產(chǎn)生和應(yīng)答來介導(dǎo)其在T_reg細(xì)胞中的功能。該研究促進(jìn)對(duì)T_reg細(xì)胞生物學(xué)的理解，這些新的見解可能為癌癥免疫治療和自身免疫性疾病中T_reg細(xì)胞活性的靶向藥理操作開辟新的途徑。