國自然新方向——組蛋白乳酸化修飾與腫瘤

組蛋白的翻譯后修飾通過調節(jié) DNA 依賴性過程（包括轉錄、復制和 DNA 修復）在維持體內平衡中發(fā)揮重要作用，這些修飾通過改變核小體之間的接觸或通過招募非組蛋白來發(fā)揮作用。組蛋白修飾與生物學過程有著密切的關系，組蛋白修飾的功能意義一直是研究熱點。組蛋白修飾的失調可以改變轉錄激活和抑制的平衡，從而導致疾病的發(fā)生和進展。因此，組蛋白修飾是與疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關的多功能標記。

組蛋白可以通過多種方式進行修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和 SUMO 化，這些方式早已為人所知。隨著高靈敏度質譜技術的發(fā)展，新發(fā)現了各種來源于細胞代謝物的組蛋白?；瘶擞洠绫；⒍□；?、琥珀?；捅；?。乳酸化修飾 (lactylation) 為芝加哥大學趙英明教授團隊于2019年在Nature雜志首次報道的一種組蛋白翻譯后修飾，發(fā)揮著基因轉錄調控的功能。組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。由于 Warburg 效應（有氧糖酵解）是癌癥的標志之一，即使在有氧條件下，癌細胞也傾向于將葡萄糖轉化成乳酸來產生能量，與正常細胞相比，葡萄糖代謝的乳酸更多。因此，腫瘤中的組蛋白乳酸化很可能是異常的，探索組蛋白修飾在疾病發(fā)病機制尤其是腫瘤發(fā)生中的作用越來越受到關注。

有研究表明，組蛋白乳酸化水平在眼部黑色素瘤中上調，組蛋白乳酸化的抑制有效地抑制了腫瘤進展。該文章發(fā)表在Genome Biology期刊上，IF=17.906.

組蛋白乳酸化水平升高與眼部黑色素瘤患者的不良預后相關

為了證明眼部黑色素瘤中蛋白質乳酸化水平異常，免疫熒光檢查了眼部黑色素瘤中的蛋白質乳酸化水平及其可能的臨床意義。眼部黑色素瘤組織的整體乳酸化水平顯著高于正常黑色素細胞組織。更高的整體乳酸化水平預示著癌癥的早期復發(fā)和增強的侵襲性。WB顯示，在大多數眼部黑色素瘤細胞系中，整體乳酸化水平也升高。有趣的是，通過免疫熒光染色，乳酸化蛋白主要位于細胞核中，并且蛋白質印跡分析中的主要條帶接近 17 kDa。然后我們在對乳酸化蛋白進行免疫沉淀后進行銀染質譜（MS），結果顯示該條帶是組蛋白H3。因此，決定調查上述現象是否是由 H3K18la 引起的。類似地，與正常黑色素細胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中的 H3K18la 水平顯示出與整體乳酸化水平相同的趨勢，H3K18la 水平升高表明預后較差。因此，在大多數眼部黑色素瘤細胞系中也觀察到了較高的 H3K18la 水平。通過WB分析證實了眼部黑色素瘤組織中升高的整體乳酸化和 H3K18la 水平。這些數據表明，大部分眼部黑色素瘤的特征是組蛋白乳酸化升高，這可能與眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生有關。

抑制組蛋白乳酸化抑制眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生

為了評估組蛋白乳酸化抑制是否減弱了眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生，使用糖酵解抑制2-DG和草酸鹽以及乳酸脫氫酶 (LDHA 和 LDHB) 的 siRNA降低了腫瘤細胞中的整體細胞內組蛋白乳酸化水平。在眼部黑色素瘤細胞（OCM1 和 CRMM1細胞）中，兩種糖酵解抑制劑均實現了細胞內乳酸的顯著劑量依賴性降低，以及整體乳酸化和 H3K18la 水平。接下來，組蛋白乳酸化降低可有效抑制眼部黑色素瘤細胞增殖。此外，菌落測定表明，組蛋白乳酸化水平較低的眼部黑色素瘤細胞形成的菌落越來越少。transwell 和傷口愈合試驗表明，這些細胞的遷移能力較弱。在體內，我們使用糖酵解抑制劑預處理的 OCM 細胞在裸鼠中建立了原位異種移植物。正如預期的那樣，減少組蛋白乳酸化組的腫瘤重量顯著低于對照組。由于2-DG和草酸鹽可能具有與抑制乳酸產生和乳酸化無關的其他作用，我們進一步沉默 LDHA 和 LDHB 以抑制組蛋白乳酸化。結果發(fā)現要么缺乏 LDHA或 LDHB眼部黑色素瘤細胞沒有表現出整體組蛋白乳酸化的顯著降低。然而，同時沉默 LDHA 和 LDHB顯著損害組蛋白的乳酸化，同時引發(fā)細胞增殖的顯著抑制和遷移。此外，向 LDHA/LDHB 缺陷細胞中添加回乳酸鈉 (Nala) 成功地增加了組蛋白的乳酸化水平和部分恢復的細胞增殖和遷移。

接下來，乳酸鈉、葡萄糖和魚藤酮用于提高眼部黑色素瘤細胞（OCM1 和 CRMM1 細胞）中的組蛋白乳酸化。然而，我們沒有觀察到細胞生長的顯著變化或集落形成能力?？傊?，組蛋白乳酸化的上調不能進一步促進眼部黑色素瘤細胞的腫瘤進展。這可能是由于眼部黑色素瘤中組蛋白乳酸化水平升高達到飽和，這足以導致腫瘤發(fā)生。盡管眼部黑色素瘤的腫瘤進展需要升高的組蛋白乳酸化，但在腫瘤發(fā)生過程中需要多因素合作。

鑒定組蛋白乳酸化的潛在下游靶基因

為了揭示組蛋白乳酸化在基因表達中的調節(jié)作用，首先進行染色質免疫沉淀，然后使用抗 H3K18la 抗體進行測序（ChIP-seq）。ChIP-seq 數據顯示 H3K18la 在啟動子區(qū)域富集。KEGG分析顯示，這些H3K18la特異性基因富含代謝途徑和腫瘤相關途徑，表明組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的調節(jié)作用。草酸鹽處理后下調基因的 KEGG 分析也富含代謝相關途徑。接下來，通過將ChIP-seq數據與是否使用糖酵解抑制劑處理的細胞的轉錄組以及正常和腫瘤細胞的轉錄組的RNA 測序（RNA-seq）數據相結合，我們鑒定了4個抗H3K18la-ChIP靶基因，它們在用糖酵解抑制劑處理的細胞中mRNA水平顯著降低，并且在腫瘤細胞中也高度表達。在這些候選基因中，YTHDF2 是m6A閱讀器之一，據報道在幾種腫瘤中充當癌基因；因此，決定專注于它。為了證實 YTHDF2 的轉錄被 H3K18la 激活，我們首先在YTHDF2啟動子處觀察到 H3K18la 信號的顯著富集。ChIP-qPCR 分析還表明，H3K18la 在YTHDF2啟動子區(qū)域中富集，并且這種富集被糖酵解抑制劑降低。此外，ChIP-qPCR 分析表明，EP300是一種組蛋白乳酸化寫入器，在用糖酵解抑制劑處理后，YTHDF2 啟動子的結合水平顯著降低。然而，EP300 的整體蛋白表達在 YTHDF2 缺陷細胞中保持不變。值得注意的是，在這種情況下，YTHDF2 啟動子的 H3K27ac 水平略有下降。正如預期的那樣，mRNA和蛋白質用糖酵解抑制劑治療后 YTHDF2 表達水平顯著降低。此外，mRNA 穩(wěn)定性分析表明糖酵解抑制劑不影響 YTHDF2 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，與 EP300 缺陷或糖酵解抑制組相比，我們注意到 YTHDF2 表達在同時沉默 EP300 和糖酵解抑制后保持不變。總的來說，這些數據表明 YTHDF2 的轉錄受到 H3K18la 的正向調節(jié)。

YTHDF2 是眼部黑色素瘤中的一種新癌基因

由于 YTHDF2 可以直接受 H3K18la 調節(jié)，我們接下來探討了它在眼部黑色素瘤中的功能。首先，我們發(fā)現 YTHDF2 在眼部黑色素瘤細胞系中的兩個 RNA 都高度表達和蛋白質水平。此外，免疫熒光染色顯示，與正常黑色素細胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中 YTHDF2 的表達顯著上調，并且 YTHDF2 的較高表達與預后不良呈正相關?；虮磉_譜交互分析（GEPIA）數據庫證實，高 YTHDF2 水平與較差的預后相關。然后，我們通過用三種shRNA沉默其表達來驗證 YTHDF2 在眼部黑色素瘤細胞中的功能。YTHDF2被成功敲低后，我們進行了CCK-8測定，結果表明與對照細胞相比，細胞生長顯著降低。此外，我們觀察到 YTHDF2 敲低抑制了腫瘤細胞集落的形成和遷移，分別通過平板集落形成測定和 transwell 測定來測量?？傊?，這些數據表明 YTHDF2 在眼部黑色素瘤中充當癌基因。

組蛋白乳酸化通過m6A閱讀器YTHDF2促進癌癥

在確定YTHDF2的表達受H3K18la調節(jié)后，我們想確定是否可以通過獲得 YTHDF2來挽救組蛋白乳酸化誘導的腫瘤抑制。在眼部黑色素瘤細胞中過表達 YTHDF2 后，糖酵解抑制劑的抗癌作用受到部分損害，包括細胞生長，菌落形成和遷移。此外，眼部黑色素瘤細胞中 YTHDF2 的過表達加速了腫瘤發(fā)生，這進一步表明 YTHDF2 功能的致癌增益?？偟膩碚f，這些結果表明 H3K18la 部分通過 YTHDF2 促進腫瘤發(fā)生。

PER1 和 TP53 可能是與 YTHDF2 相關的關鍵候選基因

為了了解 YTHDF2 在腫瘤發(fā)生中的作用機制，我們探索了數據庫，發(fā)現與 YTHDF2 相關的基因在腫瘤相關生物學中富集。 DNA修復、細胞凋亡和細胞周期等過程。進一步的 KEGG 分析表明，正相關基因在RNA降解途徑等途徑中富集，而負相關基因在代謝途徑中富集。接下來，通過將MeRIP-seq數據與用糖酵解抑制劑處理的細胞的 RNA-seq 數據，我們發(fā)現在3'UTR中具有m6A峰的13個基因在用糖酵解抑制劑處理的細胞中顯著增加，并且與TCGA數據庫中的YTHDF2呈負相關。進一步的實時 PCR (RT-PCR) 分析表明，在兩種腫瘤細胞系中，用糖酵解抑制劑處理后 ，其中2個基因（PER1 和 TP53）顯著上調。具體而言，腫瘤抑制基因 PER1和 TP53在 TCGA 數據庫中與 TYHDF2 呈負相關，而 NRAS 和 BRAF 等癌基因與 TYHDF2 呈正相關。因此，我們假設 YTHDF2 通過與各自的 m 6 A 位點結合來促進 PER1 和 TP53 的降解。

MeRIP-seq和meCLIP-seq 數據顯示 PER1 和 TP53在3' UTR區(qū)域具有 m6A位點。然后應用MeRIP-qPCR來證明 PER1和TP53 的m6A修飾。與IgG 組相比，通過與m6A特異性抗體的反應獲得了 PER1 和TP53 mRNA的富集。正如預期的那樣，RIP-qPCR分析顯示 PER1和TP53 mRNAs 主要與YTHDF2 相互作用。YTHDF2 敲低顯著上調 PER1和TP53 mRNA和蛋白質水平。此外，我們觀察到 PER1 和 TP53 被組蛋白乳酸化誘導劑 (Nala) 下調并被組蛋白乳酸化抑制劑（2-DG 和草酸鹽）上調。然后我們研究了 YTHDF2 缺陷細胞中 PER1和TP53 mRNA 穩(wěn)定性的改變。結果，YTHDF2 沉默顯著增加了 PER1 和 TP53 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，通過探索 GEPIA 數據庫，我們觀察到 PER1 的更高表達水平預示著更好的預后。與對照樣本相比，我們還觀察到眼部黑色素瘤組織樣本中的 PER1 和 TP53 水平顯著降低。接下來，我們檢查了是否可以通過沉默 PER1 和 TP53 來損害 YTHDF2 敲低效應。結果，沉默 PER1 和 TP53 部分恢復了細胞增殖。在 YTHDF2 缺陷的眼部黑色素瘤細胞中?？傊?，這些數據表明異常的 YTHDF2-PER1/TP53 軸有助于眼部黑色素瘤的腫瘤進展。

該研究最初揭示了組蛋白乳酸化通過激活m6A 閱讀蛋白YTHDF2加速腫瘤發(fā)生，從而為治療眼部黑色素瘤提供了新的組蛋白乳酸化靶點。還將組蛋白修飾與RNA修飾聯系起來，這為表觀遺傳調控提供了新的理解。