肝細(xì)胞癌（HCC）是全世界最常見(jiàn)的癌癥之一。5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并在多種癌癥中上調(diào)。然而，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在HCC中的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制尚未得到很好的研究。我們的結(jié)果顯示，在接受肝切除的HCC患者中，NSUN2表達(dá)上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)。NSUN2過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而NSUN2敲減則產(chǎn)生了相反的效果。m5C RNA免疫沉淀測(cè)序（m5C-RIP-Seq）揭示，m5C超甲基化與mRNA過(guò)表達(dá)相關(guān)，并且NSUN2介導(dǎo)的m5C超甲基化促進(jìn)了HCC患者的代謝。從機(jī)制上講，我們的數(shù)據(jù)揭示PKM2是NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾的下游靶標(biāo)。具體來(lái)說(shuō)，NSUN2可以通過(guò)增加PKM2 mRNA的3′-UTR中C773位點(diǎn)的m5C水平來(lái)穩(wěn)定PKM2 mRNA。此外，拯救實(shí)驗(yàn)表明，NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)了HCC的糖酵解和進(jìn)展?？傊狙芯拷沂玖?/span>NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過(guò)穩(wěn)定PKM2 mRNA促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的糖酵解和進(jìn)展，并為HCC患者提供了潛在的預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)。本文于2025年2月發(fā)表于“Cell Death Dis”（IF=8.1）上。
技術(shù)路線(xiàn)：
結(jié)果：
1）在肝切除術(shù)后HCC患者中，NSUN2表達(dá)上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)
為了確定mRNA m5C修飾在HCC中的作用，我們通過(guò)RT-qPCR（隊(duì)列1）評(píng)估了40對(duì)HCC和ANL（非肝細(xì)胞癌肝臟組織）組織中兩種主要的mRNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2和NSUN6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，NSUN2的mRNA水平在HCC中增加（圖1A），而NSUN6的mRNA水平?jīng)]有顯著差異（圖1B）。此外，對(duì)從隊(duì)列1中隨機(jī)選取的12對(duì)HCC和ANL組織進(jìn)行western blotting分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2的蛋白水平在HCC中也上調(diào)（圖1C）。為了確定高NSUN2表達(dá)在HCC中的臨床重要性，我們通過(guò)免疫組化（IHC）（圖1D）在另一個(gè)具有預(yù)后數(shù)據(jù)的80名HCC患者隊(duì)列（隊(duì)列2）中檢測(cè)了NSUN2的表達(dá)。此外，NSUN2蛋白在HCC中過(guò)表達(dá)。根據(jù)HCC組織中NSUN2的IHC評(píng)分中位數(shù)，我們將80名HCC患者分為高NSUN2表達(dá)組和低NSUN2表達(dá)組。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)顯示，在接受肝切除的HCC患者中，NSUN2的高表達(dá)與較低的總體生存率（OS）和較低的復(fù)發(fā)無(wú)病生存率（RFS）相關(guān)（圖1E）。
2）NSUN2在體外和體內(nèi)促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
然后，我們探討了NSUN2是否影響HCC的進(jìn)展。CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，強(qiáng)制表達(dá)NSUN2促進(jìn)了HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖2A, B），而NSUN2的耗竭抑制了HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖2C, D）。為了探索NSUN2在體內(nèi)HCC生長(zhǎng)中的作用，將NSUN2過(guò)表達(dá)的SNU387細(xì)胞及其相應(yīng)的陰性對(duì)照細(xì)胞，以及NSUN2沉默（NSUN2-sh2）的Hep3B細(xì)胞及其相應(yīng)的陰性對(duì)照細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。每周評(píng)估腫瘤體積，直到4周后處死裸鼠。NSUN2過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了SNU387細(xì)胞的生長(zhǎng)，而NSUN2敲減抑制了Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖2E, F）。此外，為了確定NSUN2在體內(nèi)HCC轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過(guò)將NSUN2過(guò)表達(dá)或NSUN2沉默的HCC細(xì)胞注射到裸鼠的尾靜脈中，建立了肺轉(zhuǎn)移模型。使用體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)HCC細(xì)胞在肺中的轉(zhuǎn)移過(guò)程，持續(xù)5周。結(jié)果顯示，NSUN2的上調(diào)增加了HCC細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，而NSUN2的下調(diào)減少了肺轉(zhuǎn)移（圖2G, H）?？偟膩?lái)說(shuō)，NSUN2能夠在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
3）NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化促進(jìn)HCC的代謝
接下來(lái)，我們探討了NSUN2在HCC中的致癌作用是否依賴(lài)于m5C。首先，為了檢測(cè)人類(lèi)HCC中的全局mRNA m5C水平，我們?cè)谖鍖?duì)HCC和ANL組織（隊(duì)列3）中進(jìn)行了m5C點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)（圖3A）。HCC中的全局mRNA m5C水平高于ANL組織。此外，我們對(duì)這五對(duì)HCC和ANL組織的mRNAs進(jìn)行了m5C-RIP-seq，以闡明HCC的轉(zhuǎn)錄組m5C譜。其中，有10684個(gè)m5C峰在8737個(gè)mRNAs中同時(shí)在HCC和ANL組織中檢測(cè)到（圖3B, C）。比較了HCC和ANL中mRNAs的m5C水平，確定了在HCC中上調(diào)的3156個(gè)甲基化峰在2696個(gè)mRNAs中，而在HCC中檢測(cè)到下調(diào)的1998個(gè)甲基化峰在1756個(gè)mRNAs中（圖3D）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明m5C在HCC中的mRNAs經(jīng)常出現(xiàn)過(guò)甲基化。mRNA m5C-RIP-seq和mRNA-Seq數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析顯示，HCC中mRNAs的表達(dá)與它們的m5C水平略微正相關(guān)（圖3E）。此外，在3156個(gè)上調(diào)的m5C峰中，對(duì)應(yīng)的499個(gè)（15.81%）mRNAs在HCC中表達(dá)上調(diào)，而只有53個(gè)（1.68%）在HCC中表達(dá)下調(diào)（圖3F）。在1998個(gè)下調(diào)的m5C峰中，對(duì)應(yīng)的85個(gè)（4.25%）mRNAs在HCC中表達(dá)上調(diào)，88個(gè)（4.40%）在HCC中表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，m5C超甲基化與HCC中mRNA的過(guò)表達(dá)正相關(guān)。KEGG通路分析顯示，既表達(dá)上調(diào)又m5C水平上調(diào)的mRNAs在十個(gè)通路中富集（圖3G）。有趣的是，癌癥中的中心碳代謝（HK2, MAPK3, MYC, PFKP, PKM2, SLC16A3）、半乳糖代謝（B4GALT2, HK2, PFKP）和果糖及甘露糖代謝（HK2, PFKFB4, PFKP）相關(guān)的通路都與代謝有關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，m5C超甲基化與HCC中的mRNA過(guò)表達(dá)和代謝相關(guān)。
4）PKM2是NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾促進(jìn)代謝的主要靶點(diǎn)
為了識(shí)別人類(lèi)HCC中NSUN2的靶mRNA，我們對(duì)Hep3B-NSUN2-sh2細(xì)胞及其相應(yīng)的陰性對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了mRNA測(cè)序。在敲減NSUN2后，有236個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，376個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4A）。然后，我們將HCC中表達(dá)上調(diào)的mRNAs、HCC中m5C水平上調(diào)的mRNAs以及Hep3B細(xì)胞中NSUN2敲減后表達(dá)下調(diào)的mRNAs進(jìn)行重疊。維恩圖顯示，有十一個(gè)mRNAs（B3GNT3, CD7, EML2, FOXC1, GDF15, LRP4, MAPT, MCTP1, PKM2, PODXL和SLC1A7）符合這些條件（圖4B, C）。我們接著在40對(duì)HCC和ANL組織中檢測(cè)了這十一個(gè)mRNAs的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其中七個(gè)在HCC中表達(dá)上調(diào)（圖4C）。此外，我們?cè)?/span>HCC細(xì)胞系中檢測(cè)了這七個(gè)mRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有PKM2在HepG2和SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后上調(diào)，而在Hep3B和Huh7細(xì)胞中沉默NSUN2后下調(diào)（圖4D, E）。根據(jù)m5C-RIP-seq的結(jié)果，PKM2 mRNA上調(diào)的m5C峰位于其3′-UTR（chr15:72491753-72491855, hg19）。針對(duì)這個(gè)峰的m5C-RIP-qPCR驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖4F）。因此，我們假設(shè)PKM2 mRNA是NSUN2的主要靶標(biāo)。
5）NSUN2通過(guò)增加其m5C水平來(lái)穩(wěn)定PKM2 mRNA
接下來(lái)，我們研究了NSUN2是否可以通過(guò)增加其m5C水平來(lái)穩(wěn)定PKM2 mRNA，從而誘導(dǎo)PKM2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NSUN2減緩了PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則產(chǎn)生了相反的效果（圖5A）。這些發(fā)現(xiàn)確認(rèn)了NSUN2可以穩(wěn)定PKM2 mRNA。此外，m5C-RIP-qPCR顯示，在SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，PKM2 mRNA的m5C水平增加，而在Hep3B細(xì)胞中敲減NSUN2后，m5C水平降低（圖5B）。為了檢測(cè)PKM2的確切m5C位點(diǎn)，我們使用針對(duì)PKM2 m5C峰的引物和從亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板進(jìn)行了亞硫酸鹽-PCR。代表性的Sanger測(cè)序色譜圖顯示，chr15:72491773（hg19）（命名為C773）的信號(hào)與胞嘧啶（‘C’，藍(lán)色）和胸腺嘧啶（‘T’，紅色）混合，表明HCC組織和細(xì)胞系中m5C被甲基化（圖5C）。使用先前描述的方法，我們計(jì)算了每個(gè)樣本中的m5C水平。例如，從SNU387-NC的PCR產(chǎn)物中亞克隆并插入T-easy載體，隨機(jī)選擇了50個(gè)克隆并進(jìn)行測(cè)序。其中，9個(gè)克隆被檢測(cè)為‘C’，而41個(gè)克隆被檢測(cè)為‘T’。因此，SNU387-NC中C773的m5C水平計(jì)算為18%（9/50）。每個(gè)樣本檢測(cè)三次。使用這種方法，也檢測(cè)了其他樣本中C773的m5C水平（圖5D–F）。HCC組織中的m5C水平高于ANL組織（圖5D）。此外，在SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，m5C水平增加，而在Hep3B細(xì)胞中敲減NSUN2后，m5C水平降低（圖5E）。為了驗(yàn)證C773在調(diào)節(jié)PKM2表達(dá)中的作用，我們使用帶有野生型PKM2 mRNA的3′-UTR的質(zhì)粒（PKM2-WT）或帶有突變C773的質(zhì)粒（PKM2-Mut）進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。正如預(yù)期的那樣，強(qiáng)制表達(dá)NSUN2增加了PKM2-WT的熒光素酶活性，但并未增加PKM2-Mut的活性（圖5F），而沉默NSUN2則抑制了這種活性，表明NSUN2對(duì)PKM2的調(diào)節(jié)作用依賴(lài)于m5C位點(diǎn)C773?？傊?/span>NSUN2可以通過(guò)增加PKM2 mRNA的3′-UTR中m5C位點(diǎn)C773的m5C水平來(lái)穩(wěn)定PKM2 mRNA。
6）NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC糖酵解和進(jìn)展
Warburg效應(yīng)的特點(diǎn)是葡萄糖攝取增加和乳酸產(chǎn)生增加。為了測(cè)試NSUN2是否可以通過(guò)增強(qiáng)PKM2介導(dǎo)的Warburg效應(yīng)來(lái)促進(jìn)HCC的進(jìn)展，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)和敲減NSUN2后檢測(cè)了葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NSUN2顯著增加了HCC細(xì)胞中的葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，而沉默NSUN2則減少了HCC細(xì)胞中的葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生（圖6A, B）。重要的是，NSUN2過(guò)表達(dá)增加了ECAR，而NSUN2沉默則減少了HCC細(xì)胞的ECAR（圖6C）。為了檢查過(guò)表達(dá)和沉默NSUN2后細(xì)胞的糖酵解能力，還進(jìn)行了GlycoPER的測(cè)定。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NSUN2導(dǎo)致HCC細(xì)胞中的GlycoPER顯著增加。此外，沉默NSUN2導(dǎo)致HCC細(xì)胞中的GlycoPER減少（圖6D）。我們接下來(lái)研究了NSUN2對(duì)HCC的影響是否是通過(guò)PKM2介導(dǎo)的。首先，我們發(fā)現(xiàn)針對(duì)PKM2的siRNA可以下調(diào)PKM2四聚體、二聚體和單體（四聚體、二聚體和單體的表達(dá)比例沒(méi)有變化）的表達(dá)，而同時(shí)過(guò)表達(dá)NSUN2可以減緩這種效果（圖6E）。其次，我們發(fā)現(xiàn)沉默PKM2抑制了葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，這種效果被過(guò)表達(dá)NSUN2所阻斷（圖6F, G）。此外，沉默PKM2降低了ECAR和GlycoPER，而同時(shí)過(guò)表達(dá)NSUN2則減緩了這種效果（圖6H, I）。另外，敲減PKM2抑制了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，這種效果被過(guò)表達(dá)NSUN2所阻斷（圖6J–L）?？傊?，NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)了HCC的糖酵解和進(jìn)展。
結(jié)論：
我們的研究揭示了NSUN2在HCC進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，并證實(shí)這種作用依賴(lài)于它的m5C修飾。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NSUN2促進(jìn)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。機(jī)制上，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過(guò)穩(wěn)定PKM2 mRNA促進(jìn)糖酵解和HCC的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)提示NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在HCC中發(fā)揮重要作用，為HCC患者提供了潛在的預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法：
KEGG通路分析、mRNA表達(dá)與m5C修飾相關(guān)性分析、m5C-RIP-seq、mRNA-Seq、基因表達(dá)分析、基因編輯與過(guò)表達(dá)、m5C點(diǎn)印跡、m5C-RIP-qPCR、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、亞硫酸鹽-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)與處理、細(xì)胞增殖與遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞代謝檢測(cè)、小鼠腫瘤模型、病理分析
參考文獻(xiàn)：
Qi Q, Zhong R, Huang Y, Tang Y, Zhang XW, Liu C, Gao CF, Zhou L, Yu J, Wu LY. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis. 2025 Feb 9;16(1):82. doi: 10.1038/s41419-025-07414-5.
