肝細胞癌（HCC）是全世界最常見的癌癥之一。5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA甲基轉移酶NSUN2參與細胞增殖和轉移，并在多種癌癥中上調。然而，NSUN2介導的m5C修飾在HCC中的生物學功能和調控機制尚未得到很好的研究。我們的結果顯示，在接受肝切除的HCC患者中，NSUN2表達上調并與預后不良相關。NSUN2過表達顯著促進了HCC的生長和轉移，而NSUN2敲減則產生了相反的效果。m5C RNA免疫沉淀測序（m5C-RIP-Seq）揭示，m5C超甲基化與mRNA過表達相關，并且NSUN2介導的m5C超甲基化促進了HCC患者的代謝。從機制上講，我們的數(shù)據(jù)揭示PKM2是NSUN2介導的m5C修飾的下游靶標。具體來說，NSUN2可以通過增加PKM2 mRNA的3′-UTR中C773位點的m5C水平來穩(wěn)定PKM2 mRNA。此外，拯救實驗表明，NSUN2通過上調PKM2促進了HCC的糖酵解和進展。總之，本研究揭示了NSUN2介導的m5C修飾通過穩(wěn)定PKM2 mRNA促進了肝細胞癌的糖酵解和進展，并為HCC患者提供了潛在的預后因素和治療靶點。本文于2025年2月發(fā)表于“Cell Death Dis”（IF=8.1）上。
技術路線：
結果：
1）在肝切除術后HCC患者中，NSUN2表達上調并與預后不良相關
為了確定mRNA m5C修飾在HCC中的作用，我們通過RT-qPCR（隊列1）評估了40對HCC和ANL（非肝細胞癌肝臟組織）組織中兩種主要的mRNA m5C甲基轉移酶NSUN2和NSUN6的表達水平。結果顯示，NSUN2的mRNA水平在HCC中增加（圖1A），而NSUN6的mRNA水平沒有顯著差異（圖1B）。此外，對從隊列1中隨機選取的12對HCC和ANL組織進行western blotting分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2的蛋白水平在HCC中也上調（圖1C）。為了確定高NSUN2表達在HCC中的臨床重要性，我們通過免疫組化（IHC）（圖1D）在另一個具有預后數(shù)據(jù)的80名HCC患者隊列（隊列2）中檢測了NSUN2的表達。此外，NSUN2蛋白在HCC中過表達。根據(jù)HCC組織中NSUN2的IHC評分中位數(shù)，我們將80名HCC患者分為高NSUN2表達組和低NSUN2表達組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，在接受肝切除的HCC患者中，NSUN2的高表達與較低的總體生存率（OS）和較低的復發(fā)無病生存率（RFS）相關（圖1E）。
2）NSUN2在體外和體內促進HCC的生長和轉移
然后，我們探討了NSUN2是否影響HCC的進展。CCK-8和Transwell實驗表明，強制表達NSUN2促進了HCC的生長和轉移（圖2A, B），而NSUN2的耗竭抑制了HCC的生長和轉移（圖2C, D）。為了探索NSUN2在體內HCC生長中的作用，將NSUN2過表達的SNU387細胞及其相應的陰性對照細胞，以及NSUN2沉默（NSUN2-sh2）的Hep3B細胞及其相應的陰性對照細胞皮下注射到裸鼠中。每周評估腫瘤體積，直到4周后處死裸鼠。NSUN2過表達顯著促進了SNU387細胞的生長，而NSUN2敲減抑制了Hep3B細胞的生長（圖2E, F）。此外，為了確定NSUN2在體內HCC轉移中的作用，我們通過將NSUN2過表達或NSUN2沉默的HCC細胞注射到裸鼠的尾靜脈中，建立了肺轉移模型。使用體內成像系統(tǒng)監(jiān)測HCC細胞在肺中的轉移過程，持續(xù)5周。結果顯示，NSUN2的上調增加了HCC細胞的肺轉移，而NSUN2的下調減少了肺轉移（圖2G, H）?？偟膩碚f，NSUN2能夠在體外和體內誘導HCC的生長和轉移。
3）NSUN2介導的m5C高甲基化促進HCC的代謝
接下來，我們探討了NSUN2在HCC中的致癌作用是否依賴于m5C。首先，為了檢測人類HCC中的全局mRNA m5C水平，我們在五對HCC和ANL組織（隊列3）中進行了m5C點雜交實驗（圖3A）。HCC中的全局mRNA m5C水平高于ANL組織。此外，我們對這五對HCC和ANL組織的mRNAs進行了m5C-RIP-seq，以闡明HCC的轉錄組m5C譜。其中，有10684個m5C峰在8737個mRNAs中同時在HCC和ANL組織中檢測到（圖3B, C）。比較了HCC和ANL中mRNAs的m5C水平，確定了在HCC中上調的3156個甲基化峰在2696個mRNAs中，而在HCC中檢測到下調的1998個甲基化峰在1756個mRNAs中（圖3D）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明m5C在HCC中的mRNAs經常出現(xiàn)過甲基化。mRNA m5C-RIP-seq和mRNA-Seq數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析顯示，HCC中mRNAs的表達與它們的m5C水平略微正相關（圖3E）。此外，在3156個上調的m5C峰中，對應的499個（15.81%）mRNAs在HCC中表達上調，而只有53個（1.68%）在HCC中表達下調（圖3F）。在1998個下調的m5C峰中，對應的85個（4.25%）mRNAs在HCC中表達上調，88個（4.40%）在HCC中表達下調。這些結果表明，m5C超甲基化與HCC中mRNA的過表達正相關。KEGG通路分析顯示，既表達上調又m5C水平上調的mRNAs在十個通路中富集（圖3G）。有趣的是，癌癥中的中心碳代謝（HK2, MAPK3, MYC, PFKP, PKM2, SLC16A3）、半乳糖代謝（B4GALT2, HK2, PFKP）和果糖及甘露糖代謝（HK2, PFKFB4, PFKP）相關的通路都與代謝有關?？偟膩碚f，m5C超甲基化與HCC中的mRNA過表達和代謝相關。
4）PKM2是NSUN2介導的m5C修飾促進代謝的主要靶點
為了識別人類HCC中NSUN2的靶mRNA，我們對Hep3B-NSUN2-sh2細胞及其相應的陰性對照細胞進行了mRNA測序。在敲減NSUN2后，有236個基因表達上調，376個基因表達下調（圖4A）。然后，我們將HCC中表達上調的mRNAs、HCC中m5C水平上調的mRNAs以及Hep3B細胞中NSUN2敲減后表達下調的mRNAs進行重疊。維恩圖顯示，有十一個mRNAs（B3GNT3, CD7, EML2, FOXC1, GDF15, LRP4, MAPT, MCTP1, PKM2, PODXL和SLC1A7）符合這些條件（圖4B, C）。我們接著在40對HCC和ANL組織中檢測了這十一個mRNAs的表達，并發(fā)現(xiàn)其中七個在HCC中表達上調（圖4C）。此外，我們在HCC細胞系中檢測了這七個mRNAs的表達，發(fā)現(xiàn)只有PKM2在HepG2和SNU387細胞中過表達NSUN2后上調，而在Hep3B和Huh7細胞中沉默NSUN2后下調（圖4D, E）。根據(jù)m5C-RIP-seq的結果，PKM2 mRNA上調的m5C峰位于其3′-UTR（chr15:72491753-72491855, hg19）。針對這個峰的m5C-RIP-qPCR驗證了這些結果（圖4F）。因此，我們假設PKM2 mRNA是NSUN2的主要靶標。
5）NSUN2通過增加其m5C水平來穩(wěn)定PKM2 mRNA
接下來，我們研究了NSUN2是否可以通過增加其m5C水平來穩(wěn)定PKM2 mRNA，從而誘導PKM2的表達。我們發(fā)現(xiàn)，過表達NSUN2減緩了PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則產生了相反的效果（圖5A）。這些發(fā)現(xiàn)確認了NSUN2可以穩(wěn)定PKM2 mRNA。此外，m5C-RIP-qPCR顯示，在SNU387細胞中過表達NSUN2后，PKM2 mRNA的m5C水平增加，而在Hep3B細胞中敲減NSUN2后，m5C水平降低（圖5B）。為了檢測PKM2的確切m5C位點，我們使用針對PKM2 m5C峰的引物和從亞硫酸鹽轉化RNA逆轉錄的cDNA模板進行了亞硫酸鹽-PCR。代表性的Sanger測序色譜圖顯示，chr15:72491773（hg19）（命名為C773）的信號與胞嘧啶（‘C’，藍色）和胸腺嘧啶（‘T’，紅色）混合，表明HCC組織和細胞系中m5C被甲基化（圖5C）。使用先前描述的方法，我們計算了每個樣本中的m5C水平。例如，從SNU387-NC的PCR產物中亞克隆并插入T-easy載體，隨機選擇了50個克隆并進行測序。其中，9個克隆被檢測為‘C’，而41個克隆被檢測為‘T’。因此，SNU387-NC中C773的m5C水平計算為18%（9/50）。每個樣本檢測三次。使用這種方法，也檢測了其他樣本中C773的m5C水平（圖5D–F）。HCC組織中的m5C水平高于ANL組織（圖5D）。此外，在SNU387細胞中過表達NSUN2后，m5C水平增加，而在Hep3B細胞中敲減NSUN2后，m5C水平降低（圖5E）。為了驗證C773在調節(jié)PKM2表達中的作用，我們使用帶有野生型PKM2 mRNA的3′-UTR的質粒（PKM2-WT）或帶有突變C773的質粒（PKM2-Mut）進行了熒光素酶報告基因實驗。正如預期的那樣，強制表達NSUN2增加了PKM2-WT的熒光素酶活性，但并未增加PKM2-Mut的活性（圖5F），而沉默NSUN2則抑制了這種活性，表明NSUN2對PKM2的調節(jié)作用依賴于m5C位點C773?？傊?，NSUN2可以通過增加PKM2 mRNA的3′-UTR中m5C位點C773的m5C水平來穩(wěn)定PKM2 mRNA。
6）NSUN2通過上調PKM2促進HCC糖酵解和進展
Warburg效應的特點是葡萄糖攝取增加和乳酸產生增加。為了測試NSUN2是否可以通過增強PKM2介導的Warburg效應來促進HCC的進展，我們在過表達和敲減NSUN2后檢測了葡萄糖攝取和乳酸產生。我們發(fā)現(xiàn)，過表達NSUN2顯著增加了HCC細胞中的葡萄糖攝取和乳酸產生，而沉默NSUN2則減少了HCC細胞中的葡萄糖攝取和乳酸產生（圖6A, B）。重要的是，NSUN2過表達增加了ECAR，而NSUN2沉默則減少了HCC細胞的ECAR（圖6C）。為了檢查過表達和沉默NSUN2后細胞的糖酵解能力，還進行了GlycoPER的測定。結果顯示，過表達NSUN2導致HCC細胞中的GlycoPER顯著增加。此外，沉默NSUN2導致HCC細胞中的GlycoPER減少（圖6D）。我們接下來研究了NSUN2對HCC的影響是否是通過PKM2介導的。首先，我們發(fā)現(xiàn)針對PKM2的siRNA可以下調PKM2四聚體、二聚體和單體（四聚體、二聚體和單體的表達比例沒有變化）的表達，而同時過表達NSUN2可以減緩這種效果（圖6E）。其次，我們發(fā)現(xiàn)沉默PKM2抑制了葡萄糖攝取和乳酸產生，這種效果被過表達NSUN2所阻斷（圖6F, G）。此外，沉默PKM2降低了ECAR和GlycoPER，而同時過表達NSUN2則減緩了這種效果（圖6H, I）。另外，敲減PKM2抑制了HCC細胞的生長和侵襲，這種效果被過表達NSUN2所阻斷（圖6J–L）?？傊?/span>NSUN2通過上調PKM2促進了HCC的糖酵解和進展。
結論：
我們的研究揭示了NSUN2在HCC進展中的關鍵作用，并證實這種作用依賴于它的m5C修飾。體外和體內實驗進一步證實了NSUN2促進HCC生長和轉移的作用。機制上，NSUN2介導的m5C修飾通過穩(wěn)定PKM2 mRNA促進糖酵解和HCC的進展。這些發(fā)現(xiàn)提示NSUN2介導的m5C修飾在HCC中發(fā)揮重要作用，為HCC患者提供了潛在的預后因素和治療靶點。
實驗方法：
KEGG通路分析、mRNA表達與m5C修飾相關性分析、m5C-RIP-seq、mRNA-Seq、基因表達分析、基因編輯與過表達、m5C點印跡、m5C-RIP-qPCR、熒光素酶報告基因實驗、亞硫酸鹽-PCR、細胞培養(yǎng)與處理、細胞增殖與遷移實驗、細胞代謝檢測、小鼠腫瘤模型、病理分析
參考文獻：
Qi Q, Zhong R, Huang Y, Tang Y, Zhang XW, Liu C, Gao CF, Zhou L, Yu J, Wu LY. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis. 2025 Feb 9;16(1):82. doi: 10.1038/s41419-025-07414-5.
