CircTTC13通過抑制鐵死亡促進肝細胞癌索拉非尼耐藥

肝細胞癌（HCC）的高死亡率主要是由于早期診斷困難以及晚期藥物耐藥性的發(fā)展。許多一線化療藥物會誘導(dǎo)鐵死亡。由于circRNA已被證明可以影響腫瘤的發(fā)展，我們研究了特定的circRNA是否可以調(diào)節(jié)HCC中的藥物誘導(dǎo)的鐵死亡。通過circRNA測序，我們發(fā)現(xiàn)了一種新的hsa_circ_0000195（circTTC13），它在HCC組織中高表達。這種過表達與更高的腫瘤分級、更晚期的腫瘤階段、減少的鐵死亡以及更差的總生存率相關(guān)。在HCC細胞系和外植腫瘤中，CircTTC13的過表達與增殖率增加、轉(zhuǎn)移能力增強以及對索拉非尼的耐藥性有關(guān)，同時抑制了鐵死亡。相反，CircTTC13的沉默減少了惡性特征并促進了鐵死亡。計算機分析、熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蜔晒庠浑s交共同表明，circTTC13直接靶向并降低了miR-513a-5p的表達，進而導(dǎo)致SLC7A11的上調(diào)。此外，抑制SLC7A11的效果與circTTC13敲低的效果相似，而鐵死亡抑制則模擬了circTTC13過表達的效果。在耐藥性HCC細胞中，circTTC13和SLC7A11的表達水平很高，而circTTC13的沉默在外植腫瘤中誘導(dǎo)了鐵死亡并逆轉(zhuǎn)了索拉非尼的耐藥性。這些發(fā)現(xiàn)表明，circTTC13通過上調(diào)SLC7A11成為HCC進展和藥物誘導(dǎo)鐵死亡抵抗的關(guān)鍵驅(qū)動因素。circTTC13/miR-513a-5p/SLC7A11軸可能是HCC的潛在治療靶點。本文于2025年1月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=27.7）上。

為了研究circRNA對HCC發(fā)生和進展的潛在貢獻，我們首先調(diào)查了手術(shù)切除的HCC組織樣本與鄰近非癌組織之間circRNA的差異表達。分析結(jié)果顯示，在HCC和鄰近組織之間有95個circRNA存在高度差異表達（圖1A和B）。通過將95個差異表達的circRNA與circBase數(shù)據(jù)庫中記錄的人類所有circRNA進行比對，我們篩選出在HCC或鄰近組織中表達最高的前5個circRNA。在識別出的7個circRNA中（其中有3個重復(fù)），我們選擇了4個尚未進行過功能研究的，并在另外20對臨床樣本中驗證了其高表達。最終，我們確定hsa_circ_0000195在HCC中差異表達（圖1C和D）。與正常人肝細胞系（THLE-2）相比，hsa_circ_0000195在4個人類HCC細胞系（HepG2、Hep3B、MHCC97H、Huh7）中也得到了過表達的確認（圖1E）。鑒于hsa_circ_0000195在Hep3B細胞中表達最高，而在HepG2細胞中表達最低，我們決定在Hep3B細胞中敲低hsa_circ_0000195，并在HepG2細胞中過表達它，以便進行后續(xù)的功能驗證。分別使用發(fā)散引物和收斂引物對cDNA和gDNA模板進行PCR。結(jié)果表明，TTC13可以從兩種DNA模板中擴增出來，而hsa_circ_0000195僅存在于cDNA模板中（圖1F）。隨后，我們對hsa_circ_0000195的基本特性進行了表征。這種circRNA是通過TTC13基因的第2-4號外顯子的環(huán)化生成的，這一過程涉及選擇性剪接，其特定的反向剪接通過Sanger測序得到了確認。因此，我們將hsa_circ_0000195命名為circTTC13。通過RNase R處理實驗（圖1H），進一步驗證了circTTC13的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性則通過放線菌素D實驗（圖1I）得到了確認。熒光原位雜交（RNA-FISH）顯示，circTTC13主要定位于Hep3B細胞的細胞質(zhì)中（圖1J）。接下來，我們展示了circTTC13的高表達與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。總共80例臨床HCC樣本根據(jù)qRT-PCR結(jié)果被分為高表達和低表達circTTC13兩組，并使用Kaplan-Meier方法比較兩組的總生存率（OS）（圖1K）。低表達circTTC13的患者組總生存期顯著更長。這些發(fā)現(xiàn)表明，circTTC13的高表達與HCC的進展和致死性相關(guān)。

為了研究circTTC13對HCC預(yù)后的影響，我們首先評估了其表達變化對體外細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。通過shRNA敲低circTTC13顯著抑制了HCC細胞系的增殖、遷移以及侵襲能力（圖2A-C）。因此，敲低circTTC13降低了關(guān)鍵的惡性特征。此外，活/死細胞染色顯示，敲低circTTC13增加了細胞死亡（圖2D），這表明circTTC13表達的降低可能會影響HCC細胞的死亡。我們用鐵死亡抑制劑Fer-1處理Hep3B細胞，該濃度對細胞活性沒有顯著影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fer-1能夠逆轉(zhuǎn)由于circTTC13沉默導(dǎo)致的細胞活性降低（圖2E）。相比之下，使用凋亡抑制劑VZAD、壞死抑制劑NEC-1、自噬抑制劑3-MA或焦亡抑制劑BELNA進行類似處理時，均未觀察到這種逆轉(zhuǎn)效果。這表明鐵死亡可能是circTTC13影響HCC進展和治療反應(yīng)的主要機制。因此，我們進一步研究了circTTC13表達與HCC中鐵死亡的相關(guān)性。沉默circTTC13的表達顯著增加了細胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累（圖2F），降低了線粒體膜電位（圖2G），提高了細胞內(nèi)Fe2?水平（圖2H）。此外，與正常HCC細胞來源的腫瘤相比，來自circTTC13沉默HCC細胞的小鼠肝臟腫瘤生長速度顯著減慢（圖2I和J）。最后，circTTC13沉默的HCC細胞來源的腫瘤表現(xiàn)出更強的鐵死亡特征，表現(xiàn)為谷胱甘肽濃度降低和脂質(zhì)過氧化物積累增加（圖2K和L）。

為了確認circTTC13沉默的抗腫瘤效應(yīng)以及鐵死亡在體內(nèi)的作用，我們在小鼠中建立了皮下腫瘤模型，通過接種表達sh-NC（對照）或sh-circTTC13（沉默）的Hep3B細胞，并比較了使用載體或Fer-1處理后的腫瘤生長情況。沉默circTTC13顯著降低了腫瘤體積和重量，這些效應(yīng)部分被Fer-1注射逆轉(zhuǎn)（圖3A-D）。此外，沉默circTTC13抑制了HCC腫瘤的進展（圖3E），下調(diào)了鐵死亡標志物GPX4的表達，并上調(diào)了4-羥基壬烯醛（4-HNE），提高了丙二醛（MDA）水平，并促進了脂質(zhì)過氧化（圖3F）。同樣，這些效應(yīng)部分被Fer-1逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，沉默circTTC13在體內(nèi)促進了鐵死亡。

為了探究circTTC13調(diào)節(jié)鐵死亡的具體機制，我們首先利用CircInteractome和CircBank數(shù)據(jù)庫搜索與circTTC13結(jié)合位點的miRNA，并確定了兩個潛在的候選者：miR-485-3p和miR-513a-5p（圖4A和B）。為了驗證這些候選miRNA與circTTC13結(jié)合的能力，我們在共轉(zhuǎn)染野生型或突變型circTTC13以及靶向miRNA模擬物或陰性對照模擬物的Hep3B細胞中進行了熒光素酶活性實驗。結(jié)果顯示，在miR-485-3p存在的情況下，共轉(zhuǎn)染野生型或突變型circTTC13的細胞熒光素酶活性沒有差異，而miR-513a-5p的共轉(zhuǎn)染顯著降低了野生型circTTC13的熒光素酶活性，但對突變型circTTC13沒有影響（圖4C和D）。此外，RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）實驗（圖4E）表明，circTTC13與miR-513a-5p在Hep3B細胞的細胞質(zhì)中共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明，circTTC13可以在細胞質(zhì)中與miR-513a-5p結(jié)合并發(fā)揮海綿作用，從而改變miR-513a-5p靶基因的表達。接下來，我們利用Starbase、TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫尋找miR-513a-5p的下游mRNA靶點。通過與FerrDb數(shù)據(jù)庫以及GeneCards中與鐵死亡相關(guān)的基因進行比對，我們確定了14個潛在的mRNA靶點，它們與鐵死亡相關(guān)（圖4F）。隨后，我們使用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫驗證了這14個與鐵死亡相關(guān)的基因在HCC中的差異表達，并通過Cox回歸、LASSO回歸、隨機森林算法和Kaplan-Meier生存分析對每個基因的預(yù)后意義進行了測試。這些分析（圖4G-K）表明，在這14個與鐵死亡相關(guān)的基因中，SLC7A11的高表達與不良預(yù)后密切相關(guān)。

我們進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪兔庖邿晒?/span>-熒光原位雜交（IF-FISH）實驗，以驗證miR-513a-5p與SLC7A11之間的相互作用。實驗結(jié)果顯示，miR-513a-5p的共轉(zhuǎn)染顯著降低了野生型SLC7A11的熒光素酶活性，但對突變型SLC7A11的熒光素酶活性沒有顯著影響。通過IF-FISH實驗，我們發(fā)現(xiàn)miR-513a-5p和SLC7A11主要在Hep3B細胞的細胞質(zhì)中共定位（圖5A-C）?；A(chǔ)實驗也證實，由于circTTC13的過表達，SLC7A11在基因和蛋白水平上的表達顯著上調(diào)。相反，circTTC13的敲低導(dǎo)致SLC7A11基因和蛋白表達水平顯著下調(diào)（圖5D和E）。沉默circTTC13抑制了HCC細胞的增殖和侵襲，降低了SLC7A11的蛋白表達，并抑制了鐵死亡，而SLC7A11的過表達則逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖5F-I）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circTTC13的促癌效應(yīng)是通過海綿吸附miR-513a-5p實現(xiàn)的，從而導(dǎo)致SLC7A11表達增加。

接下來，我們研究了SLC7A11抑制劑SSZ是否能夠逆轉(zhuǎn)circTTC13過表達對肝臟腫瘤生長和鐵死亡的影響。結(jié)果顯示，circTTC13的過表達顯著增加了腫瘤體積和重量，并加速了腫瘤的進展（圖6A-E），然而，SLC7A11蛋白的同步下調(diào)逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)。此外，circTTC13過表達對鐵死亡的調(diào)節(jié)作用也部分被SSZ逆轉(zhuǎn)（圖6F-I）。

對化療藥物耐藥的癌細胞通常對鐵死亡誘導(dǎo)更為敏感。因此，促進鐵死亡不僅可以降低癌細胞的基礎(chǔ)存活率，還可以增強化療藥物的效果。因此，我們測試了通過沉默circTTC13來促進鐵死亡是否能夠降低HCC對化療藥物的耐藥性。為此，我們建立了一個對索拉非尼耐藥的Hep3B細胞系（圖7A-D）。與親本細胞相比，這些耐藥細胞中circTTC13的表達顯著更高（圖7E）。此外，在耐藥細胞中敲低circTTC13顯著降低了細胞活性，并觸發(fā)了鐵死亡（圖7F）。此外，circTTC13的敲低還減少了由耐藥Hep3B細胞衍生的腫瘤的體積和重量（圖7G-I）。在體內(nèi)，circTTC13敲低的腫瘤表現(xiàn)出4-羥基壬烯醛（4-HNE）水平升高、亞鐵離子和丙二醛（MDA）水平增加以及谷胱甘肽（GSH）水平降低（圖7J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過誘導(dǎo)鐵死亡，circTTC13的敲低可能逆轉(zhuǎn)索拉非尼的耐藥性。最后，SLC7A11在索拉非尼耐藥的HCC細胞和組織中表達更高，而在circTTC13被敲低時受到抑制（圖7K）。這與沉默circTTC13通過下調(diào)SLC7A11來增強索拉非尼敏感性和鐵死亡的觀點一致。

circTTC13在HCC中高表達，其對鐵死亡的調(diào)節(jié)與HCC的進展和不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究為circTTC13作為HCC的生物標志物和治療靶點的潛力提供了有力的證據(jù)。

數(shù)據(jù)庫分析、生存分析、circRNA測序、基因表達分析、基因編輯與過表達、熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RNA-FISH和IF-FISH實驗、細胞培養(yǎng)與處理、細胞增殖與遷移實驗、鐵死亡相關(guān)檢測、小鼠腫瘤模型、免疫組化

Zhang Y, Yao R, Li M, Fang C, Feng K, Chen X, Wang J, Luo R, Shi H, Chen X, Zhao X, Huang H, Liu S, Yin B, Zhong C. CircTTC13 promotes sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma through the inhibition of ferroptosis by targeting the miR-513a-5p/SLC7A11 axis. Mol Cancer. 2025 Jan 27;24(1):32. doi: 10.1186/s12943-024-02224-3