泛癌scRNA-seq聯(lián)合scATAC-seq篩選CD8+T細胞終末衰竭的關鍵轉錄因子

在感染或癌癥進展過程中，初始的CD8+ T細胞在抗原識別后被激活并克隆擴增，逐漸分化為細胞毒性效應細胞和少量記憶細胞。然而，癌癥進展時，腫瘤浸潤性淋巴細胞與腫瘤共存；腫瘤微環(huán)境中持續(xù)的抗原暴露驅動T細胞抗原受體（TCR）的慢性信號傳導，破壞記憶T細胞（TM）向功能耗竭狀態(tài)的分化，最終促進免疫逃逸。耗竭性T細胞（TEX）在腫瘤中表達高水平抑制性受體、細胞毒性功能受損、增殖能力降低，通常預示著免疫檢查點阻斷（ICB）療法和過繼細胞免疫療法的臨床結果不佳。CD8+ T細胞耗竭是抗腫瘤免疫的一個關鍵障礙，該文章通過泛癌scRNA-seq聯(lián)合scATAC-seq篩選與CD8+ T耗竭相關的轉錄因子，尋找有望成為改善癌癥免疫治療效果的潛在靶點和生物標志物。該文章于2025年1月13日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF=23.5。

技術路線：

研究結果：

1. ETV7是決定CD8+T細胞耗竭的關鍵轉錄因子

為了系統(tǒng)性研究與 CD8+ T 細胞記憶和耗竭狀態(tài)相關的轉錄因子（TFs），研究者分析了來自 21 種癌癥類型、316 名患者的 CD8+ T 細胞的泛癌單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數(shù)據集（圖 1a），并結合單細胞 ATAC-seq 數(shù)據集（來自腎細胞癌和基底細胞癌的 CD8+ T 細胞），進一步篩選出結合基序富集在記憶和耗竭基因差異可及性區(qū)域的 TFs（圖 1a、b）。綜合篩選結果，研究者確定了 13 個可能驅動 T 細胞向終末耗竭分化的TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2、BACH1、VDR、ZNF282、PRDM5、ZBTB32、NR5A2、RUNX2、KLF7 和 PRDM1）。對排名前五的 TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2 和 BACH1）進行進一步驗證（圖 1c、d），它們在耗竭性 T 細胞（TEX）中上調，并與記憶和耗竭基因的表達相關（圖 1d、e）。研究者還開發(fā)了一種體外終末分化模型，通過持續(xù)的抗 CD3 和抗 CD28 刺激誘導慢性 TCR 信號傳導，以篩選控制 T 細胞終末分化的TFs（圖 1f）。與終末表型相比，記憶基因表達降低，而耗竭基因表達增加。在分化過程中，BATF、IKZF3 和 ETV7 的表達逐漸上調，其中 ETV7 的上調最為顯著，而 ZBED2 和 BACH1 的表達則隨著分化而下降?；谂R床單細胞分析和體外驗證結果，ETV7 被確定為調節(jié) CD8+ T 細胞從記憶向耗竭分化的關鍵 TF。

如果ETV7對決定T細胞終末衰竭的命運至關重要，那么它的表達必然與衰竭有關。作者首先檢測了基底細胞癌和黑色素瘤的腫瘤浸潤性CD8+T細胞中ETV7的染色質可及性。在終末分化軌跡中，ETV7的染色質狀態(tài)逐漸開放，尤其是在終末耗竭階段。與染色質狀態(tài)分析結果一致，通過對泛癌scRNA-seq數(shù)據集的CD8+ T細胞元簇進行均勻流形近似與投影可視化分析（UMAP），研究者發(fā)現(xiàn)ETV7表達細胞（ETV7+）在耗竭性T細胞（TEX）群體中富集。此外，在泛癌scRNA-seq數(shù)據集中，ETV7+細胞在分化過程中更多地富集于TEX細胞而非記憶性T細胞（TM）。ETV7在TEX細胞中高表達，類似于其他耗竭標記基因，而在表達高水平記憶標記基因的TM細胞中低表達。此外，ETV7+細胞在TEX細胞群體中的頻率顯著高于TM細胞。進一步分析顯示，在泛癌研究以及特定癌癥類型（如食管癌和子宮內膜癌）中，ETV7表達水平與記憶評分呈負相關，與耗竭評分呈正相關，表明高ETV7表達與記憶狀態(tài)向耗竭狀態(tài)的終末分化相關。

圖1 單細胞分析和體外篩選的結合鑒定出ETV7是一個關鍵的TF，可以將腫瘤浸潤性CD8+ T細胞的分化從記憶狀態(tài)轉移到耗盡狀態(tài)

圖2 在不同癌癥個體中CD8+ T細胞從記憶到衰竭的分化過程中，ETV7表達增加

2. ETV7在CD8+T細胞從記憶到耗竭分化過程中表達增加

通過比較人類scRNA-seq數(shù)據中ETV7+和ETV7?T細胞之間的差異表達基因，研究者發(fā)現(xiàn)ETV7+細胞中上調的基因在IFN相關通路中顯著富集（圖2i），ETV7表達與ISG評分呈正相關（圖2j）。這一發(fā)現(xiàn)與長期暴露于I型IFN促進慢性感染和癌癥中CD8+T細胞耗竭的觀點一致。研究者因此假設IFNs可能上調CD8+T細胞中的ETV7表達。在所有類型的IFNs中，只有IFNβ顯著增加了ETV7表達。此外，IFNβ處理以時間和濃度依賴性方式增加了ETV7的mRNA和蛋白水平。在人類原代CD8+T細胞和Jurkat細胞中也觀察到類似的結果（圖2k、l）。TCR激活是T細胞分化的基礎。與ETV7表達在TEX細胞中富集的觀察結果一致（圖2c-h），長時間的TCR刺激（超過24h）顯示出預期的但較弱的ETV7表達上調。值得注意的是，與IFNβ相比，TCR激活對ETV7表達的影響較弱且延遲，而IFNβ在24h時就顯示出顯著且持續(xù)的強效作用。這些結果表明，IFNβ可能是調節(jié)ETV7的主要因素。總之，ETV7由IFN信號誘導，標志著CD8+T細胞從記憶細胞（TM）向終末耗竭細胞（TEX）的終末分化。

3. ETV7使CD8+T細胞分化偏向耗竭

ETV7屬于E26轉化特異性（ETS）家族的轉錄因子，盡管ETV7在脊椎動物中高度保守，但它在小鼠中缺失。為了研究ETV7是否參與T細胞從記憶向終末耗竭的分化，研究者通過CRISPR-Cas9和過表達方法操縱ETV7的表達（圖3a）。在人類CD8+T細胞中，ETV7的引入抑制了記憶分化關鍵基因的表達（圖3b），并增加了耗竭基因的表達（圖3c）。相反，使用gRNA敲除ETV7可提高記憶基因的表達并抑制耗竭基因的表達（圖3b、c）。在小鼠CD8+T細胞中過表達以及在人類CD8+T細胞中敲低ETV7也獲得了類似的結果。這些發(fā)現(xiàn)與基于人類scRNA-seq數(shù)據的相關性分析一致（圖2）。研究者進一步研究了ETV7在急性感染和慢性感染病理條件下的T細胞分化效應。為了模擬急性細菌感染，研究者使用了OT-I小鼠（攜帶識別卵清蛋白（OVA）肽殘基257-264表位（OVA257-264）的轉基因TCR）。將表達ETV7或載體對照的OT-ICD8+T細胞通過尾靜脈注射到CD45.1小鼠中，隨后用Lm-OVA感染。ETV7抑制了記憶標記的表達，并在感染后第3天顯著增加了耗竭標記的表達。與之前報道一致，記憶和耗竭標記在感染后第3天表達，并在第8天逐漸降至基線水平，隨后在TM細胞中保持低水平。如預期所示，研究者觀察到ETV7+OT-I細胞在脾臟中的數(shù)量少于對照細胞。研究者還使用P14小鼠作為急性病毒感染模型，用LCMVArmstrong感染P14小鼠。將LCMV糖蛋白33-41（GP33）激活的CD8+T細胞從P14小鼠中富集出來，然后將表達ETV7或載體對照的CD45.1P14CD8+T細胞通過尾靜脈注射到CD45.2小鼠中，隨后用LCMVArmstrong感染。記憶和耗竭標記在LCMVArmstrong感染后第3天表達，并在第8天降至基線水平。值得注意的是，ETV7的引入減少了記憶標記的表達，并顯著增加了耗竭標記的表達，尤其是在感染后第3天。此外，ETV7表達顯著減少了預耗竭T細胞（TCF1+TIM3?）的數(shù)量，并增加了TEX（TCF1?TIM3+）細胞的數(shù)量。研究者進一步測試了病毒特異性CD8+T細胞（GP33特異性CD8+T細胞）的動態(tài)和功能。在病毒感染過程中，CD8+T細胞經歷了一個復雜的分化過程，包括初始激活和擴增、死亡以及TM細胞（病毒特異性）的形成。與之前報道一致，研究者觀察到在初始擴增后，GP33特異性P14CD8+T細胞的數(shù)量急劇下降。相比之下，ETV7表達顯著減少了病毒特異性CD8+T細胞的數(shù)量，削弱了這一特征表型。此外，ETV7表達顯著抑制了四聚體+細胞的細胞因子產生。因此，根據病毒動力學，ETV7表達增加了LCMVArmstrong的病毒載量。作者還使用P14小鼠模型研究了慢性感染期間CD8+T細胞的分化動力學。在慢性感染條件下，P14細胞中耗竭標記的表達逐漸增加至高水平，而記憶標記的表達則保持在低水平。與急性感染類似，ETV7顯著抑制了記憶標記的表達，并顯著增加了耗竭標記的表達。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，觀察到預耗竭T細胞數(shù)量減少，而終末耗竭T細胞（TEX）數(shù)量增加。此外，ETV7表達減少了病毒特異性CD8+T細胞的數(shù)量、病毒載量以及四聚體+細胞的細胞因子產生。這些發(fā)現(xiàn)表明，ETV7在急性感染和慢性感染中均具有抑制病毒清除的功能。

作者進一步將研究擴展到人類。在感染急性嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的個體中，CD8+T細胞中較高的ETV7表達顯示出較低的記憶狀態(tài)比例，但較高的終末耗竭狀態(tài)比例。通過對慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染個體的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據進行分析，作者發(fā)現(xiàn)表達較高水平ETV7的CD8+T細胞具有較低的增殖和記憶狀態(tài)比例，以及較高的終末耗竭評分。這些觀察結果共同支持了ETV7可能是一個調節(jié)節(jié)點，將CD8+T細胞引導至耗竭階段的觀點。

圖3 ETV7使CD8+ T細胞從記憶表型分化到衰竭表型

4. ETV7抑制CD8+T細胞的抗腫瘤功能

鑒于ETV7在CD8+T細胞分化為耗竭狀態(tài)中的關鍵作用，研究者研究了ETV7是否抑制CD8+T細胞的細胞毒性功能。研究者首先研究了在高到低TCR刺激水平下ETV7對T細胞分化的調節(jié)作用。值得注意的是，即使在極低水平的TCR刺激下，ETV7也能促進T細胞耗竭。因此，增殖、細胞因子表達以及殺傷腫瘤細胞的能力均被ETV7表達所抑制，這表明即使在低水平的TCR刺激下，ETV7也能削弱T細胞的功能。此外，ETV7表達增加了CD8+T細胞的死亡率，而通過兩種gRNA敲除ETV7可有效促進人類CD8+T細胞的增殖和細胞因子表達，即使在低水平的TCR刺激下也是如此。在人類原代CD8+T細胞中，ETV7過表達抑制了細胞因子表達和增殖，同時增強了細胞死亡（圖4a-d）。相反，gRNA敲除ETV7則增強了細胞因子的表達和增殖能力，降低了細胞死亡率（圖4a-d）。為了確定ETV7在病毒感染期間對CD8+T細胞命運決定的影響，研究者將表達ETV7或載體對照的P14CD8+T細胞注入小鼠體內，隨后用LCMVclone13感染（圖4e）。值得注意的是，在LCMVclone13感染后第3天，ETV7抑制了P14CD8+T細胞的增殖并增強了細胞死亡（圖4f,g）。這些數(shù)據表明，ETV7抑制了CD8+T細胞的效應功能。此外，ETV7缺失增加了抗原敏感性，表明ETV7可能是一個增強T細胞識別和殺傷抗原低表達癌細胞能力的靶點。研究者隨后在兩種小鼠模型（黑色素瘤B16-OVA細胞和結腸腺癌MC38-OVA細胞）中評估了抗腫瘤功能。將經過OVA肽預處理的OT-ICD8+T細胞（過表達ETV7或載體對照）轉移至免疫缺陷且攜帶B16-OVA或MC38-OVA腫瘤的小鼠體內（圖5a）。令人驚訝的是，接受ETV7過表達OT-I細胞的小鼠比對照組小鼠形成了更大的B16-OVA源性腫瘤，并且壽命更短（圖5b-d）。此外，表達ETV7的腫瘤浸潤性CD8+T細胞表現(xiàn)出記憶表型減少和耗竭表型增加（圖5e,f）。相應地，在ETV7過表達的情況下，觀察到腫瘤浸潤性CD8+T細胞數(shù)量減少、細胞因子產生和增殖能力降低、T細胞死亡增加以及腫瘤細胞死亡減少（圖5g-k）。類似地，ETV7過表達促進了MC38-OVA源性腫瘤的進展，并誘導了腫瘤浸潤性CD8+T細胞的耗竭。此外，耗竭總CD4+T細胞對ETV7的腫瘤促進功能以及CD8+T細胞耗竭的影響較小。這些研究表明，ETV7能夠限制CD8+T細胞的抗腫瘤功能。

圖4 ETV7控制CD8+ T細胞的命運

圖5 ETV7抑制CD8+ T細胞的抗腫瘤功能

5. ETV7小鼠增加腫瘤浸潤性CD8+T細胞的耗竭

接下來，研究者通過選擇性地將ETV7導入造血干細胞Lineage?Sca1+cKit+（LSK）細胞中，探索了ETV7對體內腫瘤進展的影響。在移植到致死性輻照受體小鼠兩個月后，嵌合體在外周血中成熟并被分析（圖6a）。盡管存在ETV7表達，但在CD8+T細胞和其他白細胞類型的比例和數(shù)量上未觀察到異常。如預期所示，ETV7在LSK細胞和成熟的CD8+T細胞中均有效表達（圖6b）。在此基礎上，研究者用B16腫瘤細胞接種對照組和表達ETV7的小鼠。與對照組小鼠相比，表達ETV7的小鼠顯示出B16腫瘤生長更快、腫瘤重量更高以及生存時間更短（圖6c,d）。進一步檢查發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性CD8+T細胞中記憶基因表達減少，而耗竭基因表達增加，細胞因子分泌也減少（圖6e-g）。研究者隨后研究了ETV7表達的臨床相關性。由于食管鱗狀細胞癌（ESCA）顯示出ETV7與耗竭之間最重要的相關性，并且在所有癌癥類型中ETV7+T細胞的頻率最高（圖2），研究者收集了ESCA患者的鮮組織以測量ETV7蛋白水平。高水平的ETV7與記憶蛋白TCF1表達減少和耗竭蛋白PD1和TOX表達增加密切相關（圖6h）。與研究者的體外和體內數(shù)據一致，在ESCA患者中，ETV7mRNA水平與記憶評分呈負相關，與耗竭評分呈正相關，并且隨著ESCA的分期增加，ETV7的表達也增加（圖6i），這表明ETV7可能通過促進CD8+T細胞的終末耗竭在ESCA的進展中發(fā)揮關鍵作用。由于單細胞RNA測序數(shù)據揭示ETV7主要表達在T細胞中，研究者結合了癌癥基因組圖譜數(shù)據庫中的批量RNA測序數(shù)據和生存信息，以評估ETV7表達的臨床結果。關鍵的是，在ESCA和多種其他實體瘤中，高ETV7表達組的生存率低于低表達組（圖6j）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ETV7的高表達可能導致逃避已知的CD8+T細胞靶點，并且ETV7水平可能是一個預測對免疫檢查點阻斷（ICB）治療反應的潛在生物標志物。為了進一步證實這一點，研究者納入了7名接受新輔助PD1抑制劑治療的ESCA患者。研究者將這些患者分為ETV7high（n=4）和ETV7low（n=3）兩組，并分析了他們的病理反應。

值得注意的是，所有ETV7low組患者發(fā)生病理降期，而ETV7high組患者的總體臨床分期變化極?。▓D6k）。此外，在黑色素瘤患者中，ETV7表達水平與ICB治療的反應呈負相關。這些臨床預后分析進一步支持了CD8+T細胞中ETV7的高表達可能限制其在TME中的抗腫瘤功能，并且ETV7可以作為ICB反應的潛在生物標志物。

圖6 在ESCA小鼠和個體中，ETV7增加腫瘤浸潤性CD8+T細胞的衰竭

6. ETV7驅動轉錄程序向耗竭狀態(tài)發(fā)展

ETV7能夠結合ETS共識序列（GGAA）并調節(jié)基因的轉錄活性，但目前尚不清楚其在T細胞中靶向哪些基因?；谀[瘤樣本的單細胞ATAC測序（scATAC-seq）數(shù)據，ETV7的結合基序在CD8+T細胞終末分化過程中既存在于開放區(qū)域，也存在于閉合區(qū)域（圖7a、b）。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)一些包含ETV7結合基序的閉合區(qū)域位于記憶標記基因附近，包括TCF7（以及CXCR4、CXCR5和EOMES），而一些包含ETV7結合基序的開放區(qū)域則位于耗竭標記基因附近，包括CTLA4和TOX（以及PDCD1、TNFRSF9、HAVCR2、CXCL13和LAG3），這一現(xiàn)象在癌癥患者（圖7c）和丙型肝炎病毒（HCV）感染患者中均有發(fā)現(xiàn)。因此，研究者推測ETV7可能會結合這些記憶和耗竭基因的啟動子。為了驗證這一假設，研究者通過ChIP-qPCR篩選了TCF7、CTLA4和TOX的閉合和開放區(qū)域中包含ETV7結合基序的基因組位點。結果表明，在人類和小鼠CD8+T細胞耗竭過程中，ETV7與這些位點的結合顯著增加（圖7d）。此外，啟動子活性研究表明，ETV7抑制了TCF7啟動子的活性，同時促進了CTLA4和TOX啟動子的活性（圖7e）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，ETV7過表達顯著增加了TCF7、CTLA4和TOX的mRNA和蛋白水平（圖7f、g）。此外，ETV7下調了記憶基因（如CXCR4、EOMES和CXCR5）的表達，上調了耗竭基因（如CXCL13、LAG3、PDCD1、TIM3和TNFRSF9）的表達。相反，在人類CD8+T細胞中敲除ETV7會使表達模式從耗竭狀態(tài)轉變?yōu)橛洃洜顟B(tài)（圖3b、c）。在小鼠黑色素瘤和結腸腺癌中，ETV7的表達導致腫瘤浸潤性CD8+T細胞中記憶基因表達減少，而耗竭基因表達增加（圖5和6）。為了在臨床環(huán)境中驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究者分析了多種實體瘤scRNA-seq數(shù)據，發(fā)現(xiàn)ETV7與記憶基因表達呈強負相關，與耗竭基因表達呈正相關，其中食管鱗狀細胞癌的相關性最高。這些結果表明，ETV7作為一個轉錄節(jié)點，通過結合記憶和耗竭基因來調控T細胞終末分化的基因表達。

圖7 ETV7在CD8+T細胞中作為轉錄節(jié)點，控制記憶和耗竭基因的表達

7. ETV7缺失改善CAR-T細胞的抗腫瘤治療效果

CAR-T細胞耗竭是實體瘤治療效果的主要障礙。在分析了接受抗CD19CAR-T細胞治療的B細胞惡性腫瘤患者的scRNA-seq數(shù)據集后，研究者發(fā)現(xiàn)CD8+細胞中ETV7mRNA水平與記憶評分呈負相關，與耗竭評分呈正相關（圖8a）。此外，與完全緩解（CR）組相比，部分緩解/疾病進展（PR/PD）組的ETV7表達水平更高，表明ETV7表達水平與接受抗CD19CAR-T細胞治療患者的反應和預后呈負相關（圖8b）。這些數(shù)據表明，ETV7可能會抑制CAR-T細胞的抗腫瘤效果。盡管CAR-T細胞治療在白血病中顯示出有希望的結果，但實體瘤的CAR-T細胞治療仍面臨諸多障礙和困難。為了提高CAR-T細胞在實體瘤中的抗腫瘤能力，研究者通過共表達ETV7shRNA生成了抗間皮素（抗MSLN）的CAR-T細胞。結果顯示，經過ETV7敲低改造的CAR-T細胞表現(xiàn)出正常的擴增潛力和短期（2.5h）癌細胞殺傷能力。研究者還測量了長期分化（14天）情況，發(fā)現(xiàn)ETV7缺失增加了CAR-T細胞的記憶群體比例（圖8c）。此外，經過ETV7敲低后，CAR-T細胞的耗竭群體比例和耗竭相關基因表達均有所降低（圖8d-f）。因此，ETV7敲低使CAR-T細胞從耗竭狀態(tài)轉向記憶狀態(tài)。研究者進一步在臨床前實體瘤模型中研究了ETV7失活的CAR-T細胞的表現(xiàn)。在免疫缺陷小鼠中植入過表達MSLN的OVCAR8細胞后，通過尾靜脈注射轉移了帶有或不帶有ETV7敲低的CAR-T細胞。與對照組CAR-T細胞相比，ETV7缺失的CAR-T細胞顯著減緩了腫瘤進展（圖8g），并延長了生存期。一致地，ETV7缺失增加了腫瘤浸潤性CAR-T細胞的比例，并與PD1+T細胞群體的增加密切相關（圖8h-k）。綜上所述，這些結果表明，ETV7缺失可以改善CAR-T細胞對實體瘤的治療效果，這可能為免疫治療提供了有希望的轉化潛力。

圖8 ETV7耗竭阻斷CAR-T細胞耗竭，改善CAR-T細胞抗腫瘤治療

結論：

ETV7是決定CD8+T細胞命運的關鍵轉錄因子，它通過驅動轉錄程序向耗竭狀態(tài)轉變，限制了CD8+T細胞的抗病毒和抗腫瘤效能。ETV7在多種人類癌癥中表達水平與疾病進展呈正相關，且與免疫檢查點阻斷治療的響應性呈負相關，其缺失可顯著增強CD8+T細胞和工程化CAR-T細胞在實體瘤中的抗腫瘤效能，因此ETV7有望成為改善癌癥免疫治療效果的潛在靶點和生物標志物。

實驗方法：

單細胞RNA測序（scRNA-seq）、單細胞ATAC測序（scATAC-seq）、流式細胞術、CRISPR-Cas9基因編輯技術、慢病毒介導的基因過表達、ChIP-qPCR、熒光素酶報告基因實驗、動物模型實驗、CAR-T細胞制備與功能測試。

參考文獻

Cheng, J., Xiao, Y., Peng, T. et al. ETV7 limits the antiviral and antitumor efficacy of CD8+ T cells by diverting their fate toward exhaustion. Nat Cancer (2025). https://doi.org/10.1038/s43018-024-00892-0