不同的啟動(dòng)階段通過(guò)協(xié)調(diào)旁分泌型 IL-2 信號(hào)調(diào)節(jié) CD8 T 細(xì)胞免疫力

         從T細(xì)胞的克隆增殖是適應(yīng)性免疫的基石，這一過(guò)程的啟動(dòng)稱(chēng)為T細(xì)胞“啟動(dòng)”，依賴(lài)于T細(xì)胞與抗原呈遞樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）的相互作用，涉及T細(xì)胞受體（TCR）激活、共刺激和炎癥細(xì)胞因子。這一過(guò)程在次級(jí)淋巴器官中發(fā)生，持續(xù)約24小時(shí)。之后，T細(xì)胞脫離并與DCs分離，開(kāi)始活躍遷移，并迅速增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。這篇文章的核心內(nèi)容是關(guān)于CD8 T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的激活和分化過(guò)程，特別是研究了在T細(xì)胞啟動(dòng)階段，通過(guò)協(xié)調(diào)旁分泌型IL-2信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)CD8 T細(xì)胞免疫力的機(jī)制。作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃突铙w成像技術(shù)，揭示了CD8 T細(xì)胞在淋巴結(jié)中的動(dòng)態(tài)行為以及與DCs和CD4 T細(xì)胞的相互作用，提出了CD8 T細(xì)胞啟動(dòng)的兩個(gè)階段模型，并強(qiáng)調(diào)了這些發(fā)現(xiàn)對(duì)疫苗接種和細(xì)胞免疫療法的潛在影響。該研究于2024年10月發(fā)表在《Science》，IF 44.7分。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 在時(shí)間上分離的啟動(dòng)階段中的CD8 T細(xì)胞動(dòng)態(tài)

         首先，作者研究了在病毒感染后，病毒抗原在引流淋巴結(jié)中由DCs在何種微環(huán)境中呈現(xiàn)。作者進(jìn)行了表達(dá)淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）糖蛋白（GP）的天花病毒（VV-GP）的皮下感染，并轉(zhuǎn)移了能夠通過(guò)表達(dá)熒光tdTomato進(jìn)行追蹤的特異性TCR轉(zhuǎn)基因CD8 T細(xì)胞（P14）。在感染后24小時(shí)內(nèi)，P14 T細(xì)胞聚集在引流的腘淋巴結(jié)的濾泡間和皮質(zhì)邊緣區(qū)域（圖1A），揭示了抗病毒CD8 T細(xì)胞的初始啟動(dòng)，其特征是與感染的DCs進(jìn)行長(zhǎng)期相互作用。在感染后第3天，這些T細(xì)胞已經(jīng)增殖，并且近似均勻分布在淋巴結(jié)的副皮質(zhì)中（圖1A）。

         為了測(cè)試在這一較晚時(shí)間框架內(nèi)，呈現(xiàn)GP33的DCs是否存在于該區(qū)域，作者在感染后第3天轉(zhuǎn)移了一組新的幼稚P14 T細(xì)胞。在8小時(shí)后，轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞上調(diào)了CD69并形成了簇，從而表明存在呈現(xiàn)GP33的DCs。對(duì)T細(xì)胞聚集的定位和豐度進(jìn)行系統(tǒng)分析，通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體I（MHC-I）識(shí)別病毒抗原的DCs，證實(shí)了在d3 p.i.時(shí)，抗原呈遞發(fā)生在亞濾泡區(qū)域，并在d4 p.i.時(shí)顯著下降（圖1，B和C）。

         由于其上方的大B細(xì)胞濾泡，亞濾泡區(qū)域不易通過(guò)IVM進(jìn)入。然而，在一些罕見(jiàn)的情況下，使用報(bào)告小鼠（XCR1WT/Venus），作者觀察到抗原特異性CD8 T細(xì)胞與亞濾泡區(qū)域的常規(guī)1型樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC1s）之間數(shù)小時(shí)的相互作用。為了更深入地研究這些細(xì)胞簇，并可靠地通過(guò)IVM進(jìn)入亞濾泡區(qū)域，作者使用了CD20單克隆抗體來(lái)耗盡覆蓋這些區(qū)域的B細(xì)胞。證實(shí)B細(xì)胞耗竭并未影響病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖和分化。在B細(xì)胞耗竭后，作者轉(zhuǎn)移了幼稚的P14 T細(xì)胞，應(yīng)用了CD62L阻斷抗體，隨后用VV-GP感染小鼠。在感染后第3天的引流腘淋巴結(jié)中，作者觀察到大型P14 T細(xì)胞，很可能是被激活的T細(xì)胞母細(xì)胞（淋巴母細(xì)胞），停止遷移并與cDC1s相互作用至少1小時(shí)（圖1，D到G）。

         這表明，在初始啟動(dòng)后與DCs分離后遷移的CD8 T細(xì)胞在這些亞濾泡區(qū)域與抗原呈遞的DCs重新建立了長(zhǎng)期相互作用。作者假設(shè)，在亞濾泡淋巴結(jié)區(qū)域中T細(xì)胞母細(xì)胞與cDC1s之間的這些二次緊密細(xì)胞相互作用可能有潛力塑造最終的原發(fā)性CD8 T細(xì)胞反應(yīng)：作者將此稱(chēng)為“第二次啟動(dòng)階段”。

         值得注意的是，亞濾泡淋巴結(jié)區(qū)域內(nèi)的T細(xì)胞母細(xì)胞與多個(gè)局部聚集的cDC1s相互作用，并且可能還與作者的報(bào)告小鼠未突出顯示的其他DCs相互作用（圖1D）。這與病毒感染期間的初始啟動(dòng)形成對(duì)比，初始啟動(dòng)時(shí)多個(gè)幼稚CD8 T細(xì)胞通常在IFA中圍繞單個(gè)DC形成簇。相應(yīng)地，與在d3與DC網(wǎng)絡(luò)相互作用時(shí)相比，T細(xì)胞在d1與單個(gè)DC相互作用時(shí)，簇內(nèi)T細(xì)胞密度更高。由于d3時(shí)簇內(nèi)CD8 T細(xì)胞的大小增加，作者詢(xún)問(wèn)被激活的T細(xì)胞是否繼續(xù)或只是剛剛開(kāi)始它們的增殖周期。為探究被激活的T細(xì)胞是否處于起始增殖周期，作者用增殖染料CMFDA（5-氯甲基熒光素二乙酸酯）標(biāo)記幼稚的P14 T細(xì)胞和多克隆對(duì)照CD8 T細(xì)胞，將它們共同轉(zhuǎn)移到野生型（WT）受體中，并在d3用IVM進(jìn)行分析。在非特異性對(duì)照CD8 T細(xì)胞顯示出明亮的CMFDA信號(hào)，而在停滯的P14 T細(xì)胞中，該信號(hào)已稀釋至無(wú)法檢測(cè)的水平（圖1，H和I）。因此，與DCs重新相互作用的CD8 T細(xì)胞至少已經(jīng)增殖過(guò)一次，導(dǎo)致CMFDA的熒光強(qiáng)度稀釋。

圖1：在時(shí)間上分離的CD8 T細(xì)胞啟動(dòng)階段的細(xì)胞動(dòng)態(tài)

2 CD4 T細(xì)胞在時(shí)間上分離的啟動(dòng)階段的動(dòng)態(tài)

         接下來(lái)，為了探究第二次啟動(dòng)階段中，抗原特異性CD4 T細(xì)胞的定位情況，以及它們是否會(huì)像CD8 T細(xì)胞那樣重新參與長(zhǎng)期相互作用。作者將P14 CD8（tdTomato）和特異性GP的SMARTA CD4 T細(xì)胞（Venus）共同轉(zhuǎn)移到CD11c-mCherry小鼠中，用VV-GP感染它們，并在用于檢查CD8 T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)條件下，在第2天至第3天之間進(jìn)行分析。作者發(fā)現(xiàn)SMARTA淋巴母細(xì)胞與停滯的P14 T細(xì)胞處于相同的生態(tài)位中（圖1J）。值得注意的是，在這一啟動(dòng)階段，SMARTA T細(xì)胞的遷移模式與P14 T細(xì)胞不同。SMARTA T細(xì)胞短暫停止遷移，平均與DCs相互作用10分鐘（圖1，K和L）。然后，它們以大約5 mm/min的較低速度在簇內(nèi)的DCs之間移動(dòng)（圖1M）。與這種走走停停的遷移模式一致，SMARTA T細(xì)胞的細(xì)胞位移比與DCs通常在整個(gè)60分鐘記錄期間進(jìn)行局部相互作用的P14 T細(xì)胞更高（圖1N）。在一些罕見(jiàn)的情況下，SMARTA T細(xì)胞與DCs進(jìn)行了至少持續(xù)60分鐘的長(zhǎng)期相互作用（圖1L）。

         已知CD4 Treg細(xì)胞可以控制抗病毒CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。為了可視化內(nèi)源性、多克隆Treg細(xì)胞群的細(xì)胞動(dòng)態(tài)，作者將Foxp3Cre ERT2-R26-tdTomato小鼠（通過(guò)他莫昔芬處理可以選擇性地在Foxp3表達(dá)的Treg細(xì)胞中誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)熒光tdTomato）與XCR1-Venus/WT cDC1報(bào)告小鼠進(jìn)行雜交。將OT-1 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到這些小鼠中，在VV-OVA感染后第3天，OT-1 T細(xì)胞在富含DC的樞紐中停滯（圖1O）。相比之下，在相同微環(huán)境中檢測(cè)到的Treg細(xì)胞并未停滯，而是保持了平均速度為8 mm/min的隨機(jī)遷移活動(dòng)，就像在穩(wěn)態(tài)期間一樣。這種Treg細(xì)胞的行為與抗原特異性CD8 T細(xì)胞（遷移停滯）和抗原特異性CD4 T細(xì)胞（交替停止和移動(dòng)）不同（圖1P）。值得注意的是，在T細(xì)胞啟動(dòng)的初始階段，即感染的第一天，Treg細(xì)胞也未遷移停滯（圖S1，N和O）。作者考慮了只有Treg細(xì)胞的一個(gè)亞群可能被特異性吸引到CD8 T細(xì)胞被保留的亞濾泡樞紐的可能性。

3 CXCR3促進(jìn)IL-2的獲取并促進(jìn)CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的構(gòu)建，發(fā)生在獨(dú)立的啟動(dòng)階段

         在抗原特異性細(xì)胞相互作用期間，免疫突觸的形成需要鈣離子（Ca2+）的動(dòng)員。相應(yīng)地，T細(xì)胞從DCs的分離和細(xì)胞周期的啟動(dòng)依賴(lài)于T細(xì)胞受體（TCR）的脫敏，并且與受損的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。作者分離體內(nèi)通過(guò)VV-GP激活的抗原特異性P14 T細(xì)胞，并在體外測(cè)量其對(duì)硫代硫酸鈉的Ca2+流入反應(yīng)（硫代硫酸鈉會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存耗竭，進(jìn)而激活細(xì)胞外Ca2+流入）。在感染后24小時(shí)、48小時(shí)以及72小時(shí)分離的激活P14 T細(xì)胞顯示出對(duì)硫代硫酸鈉的Ca2+流入反應(yīng)，這種反在添加細(xì)胞外Ca2+后進(jìn)一步增加（圖2A）。這些結(jié)果表明，至少有一部分T細(xì)胞在初始激活后保留了動(dòng)員Ca2+的能力——暗示其對(duì)TCR刺激能夠持續(xù)或再次獲得反應(yīng)性的潛力。這是作者觀察到的第二次啟動(dòng)階段中細(xì)胞停滯的關(guān)鍵，并且與其他研究中使用肽脈沖DCs的結(jié)果形成對(duì)比。為了進(jìn)行體內(nèi)分析，作者構(gòu)建了表達(dá)遺傳編碼的Ca2+傳感器GCaMP6F的P14 T細(xì)胞，并在第3天使用活體顯微鏡（IVM）進(jìn)行分析。作者發(fā)現(xiàn)，在亞濾泡生態(tài)位中停滯的P14 T細(xì)胞顯示出振蕩的熒光信號(hào)，表明Ca2+通量（圖2，B和C），這與TCR信號(hào)傳導(dǎo)一致。

         接下來(lái)，作者研究了哪種趨化因子受體可能參與將T細(xì)胞帶到與DCs接近的位置，并促進(jìn)更長(zhǎng)期的接觸。其中CXCR3在T細(xì)胞激活后的第2天至第3天表達(dá)上調(diào)。作者將WT[綠色熒光蛋白（GFP）]和CXCR3基因敲除（KO）OT-1 T細(xì)胞（用tdTomato標(biāo)記）轉(zhuǎn)移到WT受體中，用VV-OVA感染它們，并在3天后分析其在組織切片中的定位（使用共聚焦顯微鏡）?；谒鼈兊目臻g積累或與淋巴結(jié)被膜的距離，WT和CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞在引流淋巴結(jié)中的整體分布相似，但它們的動(dòng)態(tài)行為可能不同。因此，作者在相同條件下應(yīng)用IVM直接比較WT和CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞的遷移行為，發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO和WT細(xì)胞聚集在一起；然而，遷移停滯的CXCR3 KO細(xì)胞的比例低于WT OT-1 T細(xì)胞（圖2，D到H）。同樣，WT OT-1 T細(xì)胞的平均速度和軌跡位移長(zhǎng)度也低于CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞（圖2，E和F）。此外，少數(shù)停滯的CXCR3 KO細(xì)胞平均停滯時(shí)間更短（圖2G）。作者發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)到OT-1 T細(xì)胞簇的區(qū)域，CXCR3 KO T細(xì)胞的數(shù)量比其WT對(duì)應(yīng)細(xì)胞少約三倍（圖2H）。IVM分析顯示，WT與CXCR3 KO OT1 T細(xì)胞的總體豐度相似（圖2H）。這些結(jié)果說(shuō)明CXCR3并不調(diào)節(jié)激活的CD8 T細(xì)胞的整體分布，而是影響它們?cè)谔囟▉啚V泡樞紐中的募集和/或保留。

         為此作者重新分析了WT和CXCR3 KO OT-1細(xì)胞在組織切片上的分布。作者將WT和CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并用VV-OVA和VV-GP感染小鼠。在分析前8小時(shí)，作者轉(zhuǎn)入了一組新的抗原特異性幼稚SMARTA T細(xì)胞作為細(xì)胞探針，以揭示激活的OT-1 T細(xì)胞被保留的生態(tài)位（圖2I）。具體來(lái)說(shuō)，作者使用激活的（CD69+）SMARTA T細(xì)胞作為參考點(diǎn)，并在淋巴結(jié)組織切片的共聚焦圖像上測(cè)量WT和CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞的距離。與IVM結(jié)果相符，作者發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO T細(xì)胞比其WT對(duì)應(yīng)細(xì)胞參考點(diǎn)更遠(yuǎn)（圖2J）。這些結(jié)果表明，在第二次啟動(dòng)階段，CXCR3促進(jìn)了激活的CD8 T細(xì)胞在特定亞濾泡樞紐中的獲取和細(xì)胞停滯。

         接下來(lái)，為了探究感染后第3天CXCR3依賴(lài)的相互作用期間傳遞了哪些信號(hào)，作者在感染第8天分析CD8 T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)此時(shí)CD8 T細(xì)胞已完全分化為效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）。與已發(fā)表的結(jié)果一致，作者發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO CD8 T細(xì)胞未能在感染后第8天在淋巴結(jié)中通過(guò)Killer細(xì)胞凝集素樣受體G1（KLRG1）表達(dá)分化為Teff（圖2，K到M）。IL-12作為信號(hào)3細(xì)胞因子，指導(dǎo)CD8 T細(xì)胞分化，并且能夠產(chǎn)生IL-12的細(xì)胞可以通過(guò)使用將黃色熒光蛋白（YFP）表達(dá)與p40亞基（IL-12p40-IRES-eYFP）偶聯(lián)的小鼠來(lái)檢測(cè)。在IL-12p40-IRES-eYFP小鼠中，表達(dá)YFP的cDC1s在相關(guān)生態(tài)位中富集，并在第3天與激活的OT-1相互作用（圖S2，H到J）。作者前期工作已經(jīng)證明cDC1s對(duì)于CD8 T細(xì)胞記憶構(gòu)建至關(guān)重要，但并非Teff細(xì)胞分化所必需。對(duì)XCR1WT/DTR（DTR，白喉毒素受體）小鼠進(jìn)行白喉毒素處理效果理想，導(dǎo)致cDC1s減少了98%。然而，cDC1耗竭并未阻止CD8 T細(xì)胞在第3天停滯，表明在這一啟動(dòng)階段，cDC1和IL-12信號(hào)傳導(dǎo)是冗余的。

         因此，作者將注意力轉(zhuǎn)向調(diào)節(jié)CD8 T細(xì)胞分化的重要因子IL-2，并探究這種細(xì)胞因子是否在通過(guò)CXCR3獲取的細(xì)胞樞紐中被感知。作者將WT和CXCR3 KO OT-1 T細(xì)胞共同轉(zhuǎn)移到WT受體中，用VV-OVA感染它們，并在感染后第3天，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子5（pSTAT5）的磷酸化，作為IL-2信號(hào)傳導(dǎo)的衡量標(biāo)準(zhǔn)。作者發(fā)現(xiàn)與WT OT-1 T細(xì)胞相比，CXCR3 KO細(xì)胞中的pSTAT5水平降低（圖2，N和O）。

         CD8 T細(xì)胞的增殖能力與T細(xì)胞因子1（TCF1）蛋白的表達(dá)相關(guān)，該蛋白由Tcf7基因編碼。因此，作者探究了是否主要表達(dá)低或高TCF1水平的CD8 T細(xì)胞母細(xì)胞獲得了對(duì)富含IL-2的生態(tài)位的訪問(wèn)。在感染后第3天，作者發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移的P14 TCF7GFP細(xì)胞中，pSTAT5陽(yáng)性細(xì)胞的比例在TCF1低細(xì)胞中高于TCF1高細(xì)胞，這與TCF1低細(xì)胞中CXCR3、CD25和TCRβ的高表達(dá)水平一致（圖2，P到R）。然而，由于作者無(wú)法在IVM期間區(qū)分轉(zhuǎn)移的P14 TCF7GFP細(xì)胞中的TCF1低和TCF1高細(xì)胞，因此尚需確定在這一獨(dú)特的啟動(dòng)階段，CD8 T細(xì)胞在哪個(gè)特定的分化階段重新與DCs相互作用?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的結(jié)果表明，CD8 T細(xì)胞表達(dá)的CXCR3通過(guò)在第二次啟動(dòng)階段優(yōu)化對(duì)亞濾泡生態(tài)位中IL-2的訪問(wèn)，促進(jìn)了Teff的構(gòu)建。

圖2：CXCR3提供對(duì)IL-2的訪問(wèn)，并促進(jìn)CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的構(gòu)建，發(fā)生在獨(dú)立的啟動(dòng)階段

4 Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)調(diào)控CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的構(gòu)建，但獨(dú)立于CXCR3

         Treg細(xì)胞通過(guò)限制IL-2來(lái)部分調(diào)控抗病毒適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而抑制CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增和Teff分化。利用Foxp3-DTR小鼠耗竭Treg細(xì)胞后，在VV-OVA感染后第8天，病毒特異性、VVB8R四聚體結(jié)合的CD8 T細(xì)胞中表達(dá)Teff細(xì)胞標(biāo)記物KLRG1的比例增加（圖3A）。同時(shí)，如果在初始啟動(dòng)階段后24小時(shí)耗竭Treg細(xì)胞，這些病毒特異性CD8 T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量也會(huì)增加（圖3B）。當(dāng)在感染后48小時(shí)耗竭Treg細(xì)胞時(shí)，也觀察到了這種效應(yīng)，表明Treg細(xì)胞的調(diào)控與CD8 T細(xì)胞在淋巴結(jié)中的第二次啟動(dòng)階段在時(shí)間上有所重疊。一致地，感染后48小時(shí)耗竭Treg細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致在VV-OVA感染后第3天過(guò)繼轉(zhuǎn)移的OT-1 T細(xì)胞中pSTAT5水平增加（圖3C）。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，Treg細(xì)胞通過(guò)減少IL-2的可用性來(lái)抑制CD8 T細(xì)胞的增殖和分化。值得注意的是，與OT-1 T細(xì)胞相比，Treg細(xì)胞的pSTAT5水平較低，這與其在富含IL-2的生態(tài)位中停留時(shí)間較短的結(jié)果一致（圖1，O和P）。

         由于抗病毒CD8 T細(xì)胞需要CXCR3才能與輔助性CD4 T細(xì)胞在亞濾泡簇中共定位，作者研究了Treg細(xì)胞表達(dá)CXCR3是否是限制CD8 T細(xì)胞分化的必要條件，通過(guò)感染CXCR3ΔFoxp3（Foxp3Cre × Cxcr3fl/fl）小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與WT小鼠相比，感染后第8天，表達(dá)KLRG1的CD8 T細(xì)胞的比例以及VVB8R四聚體結(jié)合的CD8 T細(xì)胞的總數(shù)均未發(fā)生改變（圖3，D和E）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，Treg細(xì)胞對(duì)病毒特異性CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)控并不需要CXCR3的表達(dá)。只有部分Treg細(xì)胞磷酸化STAT5的觀察結(jié)果，提示在感染后第3天，特定亞群的Treg細(xì)胞可能在這些相互作用中調(diào)控CD8 T細(xì)胞。

         為了解析Treg細(xì)胞的異質(zhì)性和激活程序，作者從未感染和VV-OVA感染的Foxp3-GFP小鼠的淋巴結(jié)中分選Treg細(xì)胞，然后進(jìn)行標(biāo)記和混合，以便進(jìn)行scRNA-seq。在穩(wěn)態(tài)下，作者檢測(cè)到三個(gè)不同的Treg細(xì)胞簇，相應(yīng)地，在感染后也檢測(cè)到三個(gè)簇，以及一個(gè)混合簇（圖3F）。作者將其中一個(gè)簇命名為效應(yīng)Treg（eTreg）細(xì)胞，其特征是表達(dá)Cd44、Icos、Tnfrsf9以及多種趨化因子受體，如Cxcr3和Ccr2（圖3G）。在穩(wěn)態(tài)下，該簇在與IL-2依賴(lài)通路相關(guān)的基因表達(dá)評(píng)分中最高（圖3H）。另外兩個(gè)獨(dú)立的簇表達(dá)Sell（CD62L）、Ccr7和Klf2，并且IL-2信號(hào)評(píng)分較低，因此作者將其稱(chēng)為靜止Treg（rTreg）細(xì)胞（圖3，G和H）。最后，剩余的簇具有混合特征，其特征是表達(dá)Cd69和Nr4a1，表明存在活躍的TCR信號(hào)傳導(dǎo)（圖3G）?？傮w而言，感染后，Treg細(xì)胞的Ifit3和Socs1表達(dá)增加，說(shuō)明IFN-γ和IL-2依賴(lài)通路的激活增加（圖3，H到K）。值得注意的是，與IFN信號(hào)相關(guān)的基因表達(dá)相比，感染后IL-2信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的增加主要出現(xiàn)在rTreg細(xì)胞中（圖3，G和H）。從成像（圖1O）和功能數(shù)據(jù)（圖3，A到E）來(lái)看，Treg細(xì)胞在感染后被全局激活，并獨(dú)立于CXCR3進(jìn)入相關(guān)生態(tài)位的途徑。從功能上講，Treg細(xì)胞似乎限制了IL-2的總體豐度，從而限制其可用性。相應(yīng)地，在缺乏Treg細(xì)胞的情況下，CXCR3基因敲除（KO）OT-1 T細(xì)胞的Teff細(xì)胞構(gòu)建得以恢復(fù)，這表現(xiàn)為在VV-OVA感染后，相對(duì)數(shù)量以及在較小程度上絕對(duì)數(shù)量的KLRG1表達(dá)細(xì)胞增加（圖3L）。然而，IL-2的可用性在多大程度上受到Treg細(xì)胞在這些亞濾泡啟動(dòng)樞紐內(nèi)外的調(diào)控仍不清楚。因此，作者得出結(jié)論，促進(jìn)CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子構(gòu)建的第二次啟動(dòng)階段受到Treg細(xì)胞的限制，而Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)地穿越生態(tài)位且獨(dú)立于CXCR3。

圖3：Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)調(diào)控CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的構(gòu)建，但獨(dú)立于CXCR3

5 CD4 T細(xì)胞提供旁分泌IL-2以促進(jìn)CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的分化和擴(kuò)增

         為了確定第二次啟動(dòng)階段中IL-2的細(xì)胞來(lái)源，作者構(gòu)建了IL2ΔCD8（CD8aCre × Il2fl/fl）小鼠，并在VV-OVA感染后第8天分析了VVB8R四聚體結(jié)合的CD8 T細(xì)胞。在CD8 T細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生IL-2的小鼠中，作者沒(méi)有觀察到Teff構(gòu)建的差異， CD8 T細(xì)胞數(shù)量和表達(dá)KLRG1及CX3CR1的細(xì)胞比例沒(méi)有變化（圖4，A到C）。

         接下來(lái)，作者將注意力集中在CD4 T細(xì)胞上，認(rèn)為它們可能是亞濾泡區(qū)域中傳遞的旁分泌IL-2的潛在來(lái)源。在通過(guò)抗體介導(dǎo)耗竭CD4 T細(xì)胞后，作者在感染后第3天觀察到轉(zhuǎn)移的OT-1 T細(xì)胞中pSTAT5水平降低（圖4D）。然而，在其他研究中，CD4 T細(xì)胞耗竭對(duì)急性抗病毒CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的影響較小。這些觀察結(jié)果與IL-2Rα缺陷（CD25 KO）OT-1 T細(xì)胞的CD8 T細(xì)胞擴(kuò)增和效應(yīng)分化顯著減少形成對(duì)比（圖4，E到G），這提示CD4輔助T細(xì)胞可能產(chǎn)生冗余的IL-2。

         目前用于評(píng)估CD4 T細(xì)胞輔助作用的模型（例如MHC-II缺陷或抗體介導(dǎo)的CD4 T細(xì)胞耗竭）并不具有細(xì)胞類(lèi)型特異性，會(huì)導(dǎo)致同時(shí)丟失具有抑制作用的CD4表達(dá)的Treg細(xì)胞。為了選擇性地耗竭CD4輔助T細(xì)胞（CD4help），同時(shí)保持Treg細(xì)胞群完整，作者構(gòu)建了CD4-DTR小鼠，其中DTR由兩個(gè)loxP位點(diǎn)包圍，并將其與Foxp3Cre ERT2小鼠雜交（此后稱(chēng)為CD4help-DTR）。經(jīng)過(guò)他莫昔芬處理后，Cre介導(dǎo)的重組在Treg細(xì)胞中切除DTR，從而在白喉毒素（DT）給藥后使它們免于細(xì)胞死亡（圖4，H和I）。事實(shí)上，在VV感染后第8天，WT和CD4-DTR小鼠中VVB8R四聚體陽(yáng)性的CD8 T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量相似，這些小鼠中同時(shí)耗竭了輔助性和調(diào)節(jié)性CD4 T細(xì)胞。相比之下，使用CD4help-DTR小鼠選擇性耗竭CD4輔助T細(xì)胞后，病毒特異性CD8 T細(xì)胞的數(shù)量減少了五倍以上（圖4J）。此外，在CD4-DTR和CD4help-DTR小鼠中，KLRG1+或CX3CR1+ VVB8R四聚體陽(yáng)性Teff細(xì)胞的頻率降低（圖4，K和L），并且它們的絕對(duì)數(shù)量在CD4help-DTR小鼠中進(jìn)一步減少。這些數(shù)據(jù)確立了CD4輔助細(xì)胞已知記憶細(xì)胞功能外的在決定急性抗病毒CD8 T細(xì)胞反應(yīng)數(shù)量中的作用。此外，這些結(jié)果還暗示Treg細(xì)胞可以在沒(méi)有CD4輔助T細(xì)胞的情況下發(fā)揮抑制作用。

圖4：CD4 T細(xì)胞提供旁分泌IL-2以促進(jìn)CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子的分化和擴(kuò)增

6 CD8 T細(xì)胞第二次啟動(dòng)階段的親和力選擇

         作者的研究結(jié)果揭示了一個(gè)獨(dú)特的T細(xì)胞啟動(dòng)階段，該階段負(fù)責(zé)將CD4輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的旁分泌IL-2傳遞給CD8 Teff，以調(diào)控其分化和擴(kuò)增。這些發(fā)現(xiàn)與調(diào)節(jié)B細(xì)胞及其在生發(fā)中心反應(yīng)期間的克隆選擇以實(shí)現(xiàn)親和力成熟的CD4 T細(xì)胞輔助功能存在相似之處。因此，作者研究了CD8 T細(xì)胞的第二次啟動(dòng)階段是否也可能類(lèi)似地用于選擇高親和力的CD8 T細(xì)胞克隆以進(jìn)一步擴(kuò)增。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者將低親和力的OVA257特異性CD8 T細(xì)胞（OT-3）與它們的高親和力對(duì)應(yīng)細(xì)胞（OT-1）的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行了比較。在VV-OVA感染后第1天，對(duì)淋巴結(jié)濾泡間區(qū)域（IFA）的活體顯微鏡（IVM）觀察顯示，在初始啟動(dòng)階段，OT-1和OT-3 T細(xì)胞的遷移停滯并共同聚集（圖5，A到D）。通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)淋巴結(jié)切片的連續(xù)分析證實(shí)了這一結(jié)果，OT-1和OT-3 T細(xì)胞均表達(dá)CD69，說(shuō)明這兩種細(xì)胞通過(guò)TCR介導(dǎo)被激活（圖5E）。

         已有研究表明，T細(xì)胞受體（TCR）親和力控制T細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）相互作用的持續(xù)時(shí)間，作者也觀察到T細(xì)胞與DC相互作用的動(dòng)態(tài)存在細(xì)微差異（圖5B）。然而，OT-1和OT-3細(xì)胞以相似的方式增殖（圖5F），并在第3天在淋巴結(jié)中達(dá)到了相當(dāng)?shù)慕^對(duì)數(shù)量（圖5G）。

         接下來(lái)，作者通過(guò)將OT-3 T細(xì)胞與OT-1 T細(xì)胞在同一個(gè)淋巴結(jié)中直接比較，分析了OT-3 T細(xì)胞在第二次啟動(dòng)階段的動(dòng)態(tài)行為。與OT-1 T細(xì)胞不同，低親和力的OT-3 T細(xì)胞未能與DC進(jìn)行長(zhǎng)期重新相互作用（圖5，I到L）。一致地，盡管CD25水平相似，但在感染后第3天，OT-3 T細(xì)胞中pSTAT5陽(yáng)性的比例低于OT-1 T細(xì)胞（圖5，M和N），證實(shí)了OT-3 T細(xì)胞對(duì)富含IL-2的生態(tài)位的訪問(wèn)受限。為了測(cè)試由這些生態(tài)位中的DC網(wǎng)絡(luò)調(diào)控屬于細(xì)胞內(nèi)在還是細(xì)胞外在，作者在感染后第3天將幼稚的OT-1和OT-3 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，并分析它們的激活模式和定位。轉(zhuǎn)移后8小時(shí)，作者通過(guò)CD69上調(diào)檢測(cè)到幼稚OT-3 T細(xì)胞的強(qiáng)烈激活，盡管其頻率低于OT-1 T細(xì)胞（圖5O）。值得注意的是，在組織切片上，OT-1和OT-3 T細(xì)胞在淋巴結(jié)的相同生態(tài)位中共同聚集（圖5P）。這些結(jié)果表明，低親和力T細(xì)胞在第二次啟動(dòng)階段未能積累相同水平的IL-2信號(hào)，這是由于它們?cè)诔跏技せ詈蠡?span>TCR的遷移停滯能力發(fā)生了改變。與之相關(guān)的是，在感染后第8天檢測(cè)到的OT-3 T細(xì)胞數(shù)量比OT-1 T細(xì)胞減少了10倍以上（圖5Q）。同樣，OT-3 T細(xì)胞的Teff構(gòu)建，以表達(dá)KLRG1和CX3CR1的細(xì)胞比例為指標(biāo)，也低于OT-1 T細(xì)胞（圖5，R和S），并且其數(shù)量減少了100倍以上。Treg細(xì)胞耗竭并不能在感染后增加OT-3細(xì)胞的總數(shù)，但確實(shí)增加了其中Teff細(xì)胞的比例。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)與以下觀點(diǎn)一致：第二次啟動(dòng)階段的作用是選擇高親和力的CD8 T細(xì)胞克隆，以通過(guò)CD4 T細(xì)胞衍生的IL-2信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)增和分化。

圖5：在時(shí)間上分離的CD8 T細(xì)胞啟動(dòng)階段的親和力選擇

結(jié)論：

         綜上所述，作者研究揭示了CD8 T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的兩個(gè)啟動(dòng)階段，其中第二階段通過(guò)CD4 T細(xì)胞提供的IL-2信號(hào)和Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，選擇性地促進(jìn)高親和力CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增和分化，為疫苗和免疫療法的開(kāi)發(fā)提供了新機(jī)制和靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         活體成像技術(shù)（IVM），流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞遷移模式分析，scRNA-seq，免疫熒光，細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)：

         Jobin K, Seetharama D, Rüttger L, Fenton C, Kharybina E, Wirsching A, Huang A, Kn?pper K, Kaisho T, Busch DH, Vaeth M, Saliba AE, Graw F, Pulfer A, González SF, Zehn D, Liang Y, Ugur M, Gasteiger G, Kastenmüller W. A distinct priming phase regulates CD8 T cell immunity by orchestrating paracrine IL-2 signals. Science. 2025 Apr 11;388(6743):eadq1405. doi: 10.1126/science.adq1405. Epub 2025 Apr 11. PMID: 40208984.