不同的啟動階段通過協(xié)調(diào)旁分泌型 IL-2 信號調(diào)節(jié) CD8 T 細胞免疫力

         從T細胞的克隆增殖是適應性免疫的基石，這一過程的啟動稱為T細胞“啟動”，依賴于T細胞與抗原呈遞樹突狀細胞（DCs）的相互作用，涉及T細胞受體（TCR）激活、共刺激和炎癥細胞因子。這一過程在次級淋巴器官中發(fā)生，持續(xù)約24小時。之后，T細胞脫離并與DCs分離，開始活躍遷移，并迅速增殖分化為效應T細胞和記憶T細胞。這篇文章的核心內(nèi)容是關于CD8 T細胞在免疫反應中的激活和分化過程，特別是研究了在T細胞啟動階段，通過協(xié)調(diào)旁分泌型IL-2信號來調(diào)節(jié)CD8 T細胞免疫力的機制。作者通過實驗模型和活體成像技術，揭示了CD8 T細胞在淋巴結中的動態(tài)行為以及與DCs和CD4 T細胞的相互作用，提出了CD8 T細胞啟動的兩個階段模型，并強調(diào)了這些發(fā)現(xiàn)對疫苗接種和細胞免疫療法的潛在影響。該研究于2024年10月發(fā)表在《Science》，IF 44.7分。

技術路線：

主要研究結果：

1 在時間上分離的啟動階段中的CD8 T細胞動態(tài)

         首先，作者研究了在病毒感染后，病毒抗原在引流淋巴結中由DCs在何種微環(huán)境中呈現(xiàn)。作者進行了表達淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）糖蛋白（GP）的天花病毒（VV-GP）的皮下感染，并轉(zhuǎn)移了能夠通過表達熒光tdTomato進行追蹤的特異性TCR轉(zhuǎn)基因CD8 T細胞（P14）。在感染后24小時內(nèi)，P14 T細胞聚集在引流的腘淋巴結的濾泡間和皮質(zhì)邊緣區(qū)域（圖1A），揭示了抗病毒CD8 T細胞的初始啟動，其特征是與感染的DCs進行長期相互作用。在感染后第3天，這些T細胞已經(jīng)增殖，并且近似均勻分布在淋巴結的副皮質(zhì)中（圖1A）。

         為了測試在這一較晚時間框架內(nèi)，呈現(xiàn)GP33的DCs是否存在于該區(qū)域，作者在感染后第3天轉(zhuǎn)移了一組新的幼稚P14 T細胞。在8小時后，轉(zhuǎn)移的T細胞上調(diào)了CD69并形成了簇，從而表明存在呈現(xiàn)GP33的DCs。對T細胞聚集的定位和豐度進行系統(tǒng)分析，通過主要組織相容性復合體I（MHC-I）識別病毒抗原的DCs，證實了在d3 p.i.時，抗原呈遞發(fā)生在亞濾泡區(qū)域，并在d4 p.i.時顯著下降（圖1，B和C）。

         由于其上方的大B細胞濾泡，亞濾泡區(qū)域不易通過IVM進入。然而，在一些罕見的情況下，使用報告小鼠（XCR1WT/Venus），作者觀察到抗原特異性CD8 T細胞與亞濾泡區(qū)域的常規(guī)1型樹突狀細胞（cDC1s）之間數(shù)小時的相互作用。為了更深入地研究這些細胞簇，并可靠地通過IVM進入亞濾泡區(qū)域，作者使用了CD20單克隆抗體來耗盡覆蓋這些區(qū)域的B細胞。證實B細胞耗竭并未影響病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的增殖和分化。在B細胞耗竭后，作者轉(zhuǎn)移了幼稚的P14 T細胞，應用了CD62L阻斷抗體，隨后用VV-GP感染小鼠。在感染后第3天的引流腘淋巴結中，作者觀察到大型P14 T細胞，很可能是被激活的T細胞母細胞（淋巴母細胞），停止遷移并與cDC1s相互作用至少1小時（圖1，D到G）。

         這表明，在初始啟動后與DCs分離后遷移的CD8 T細胞在這些亞濾泡區(qū)域與抗原呈遞的DCs重新建立了長期相互作用。作者假設，在亞濾泡淋巴結區(qū)域中T細胞母細胞與cDC1s之間的這些二次緊密細胞相互作用可能有潛力塑造最終的原發(fā)性CD8 T細胞反應：作者將此稱為“第二次啟動階段”。

         值得注意的是，亞濾泡淋巴結區(qū)域內(nèi)的T細胞母細胞與多個局部聚集的cDC1s相互作用，并且可能還與作者的報告小鼠未突出顯示的其他DCs相互作用（圖1D）。這與病毒感染期間的初始啟動形成對比，初始啟動時多個幼稚CD8 T細胞通常在IFA中圍繞單個DC形成簇。相應地，與在d3與DC網(wǎng)絡相互作用時相比，T細胞在d1與單個DC相互作用時，簇內(nèi)T細胞密度更高。由于d3時簇內(nèi)CD8 T細胞的大小增加，作者詢問被激活的T細胞是否繼續(xù)或只是剛剛開始它們的增殖周期。為探究被激活的T細胞是否處于起始增殖周期，作者用增殖染料CMFDA（5-氯甲基熒光素二乙酸酯）標記幼稚的P14 T細胞和多克隆對照CD8 T細胞，將它們共同轉(zhuǎn)移到野生型（WT）受體中，并在d3用IVM進行分析。在非特異性對照CD8 T細胞顯示出明亮的CMFDA信號，而在停滯的P14 T細胞中，該信號已稀釋至無法檢測的水平（圖1，H和I）。因此，與DCs重新相互作用的CD8 T細胞至少已經(jīng)增殖過一次，導致CMFDA的熒光強度稀釋。

圖1：在時間上分離的CD8 T細胞啟動階段的細胞動態(tài)

2 CD4 T細胞在時間上分離的啟動階段的動態(tài)

         接下來，為了探究第二次啟動階段中，抗原特異性CD4 T細胞的定位情況，以及它們是否會像CD8 T細胞那樣重新參與長期相互作用。作者將P14 CD8（tdTomato）和特異性GP的SMARTA CD4 T細胞（Venus）共同轉(zhuǎn)移到CD11c-mCherry小鼠中，用VV-GP感染它們，并在用于檢查CD8 T細胞的實驗條件下，在第2天至第3天之間進行分析。作者發(fā)現(xiàn)SMARTA淋巴母細胞與停滯的P14 T細胞處于相同的生態(tài)位中（圖1J）。值得注意的是，在這一啟動階段，SMARTA T細胞的遷移模式與P14 T細胞不同。SMARTA T細胞短暫停止遷移，平均與DCs相互作用10分鐘（圖1，K和L）。然后，它們以大約5 mm/min的較低速度在簇內(nèi)的DCs之間移動（圖1M）。與這種走走停停的遷移模式一致，SMARTA T細胞的細胞位移比與DCs通常在整個60分鐘記錄期間進行局部相互作用的P14 T細胞更高（圖1N）。在一些罕見的情況下，SMARTA T細胞與DCs進行了至少持續(xù)60分鐘的長期相互作用（圖1L）。

         已知CD4 Treg細胞可以控制抗病毒CD8 T細胞反應。為了可視化內(nèi)源性、多克隆Treg細胞群的細胞動態(tài)，作者將Foxp3Cre ERT2-R26-tdTomato小鼠（通過他莫昔芬處理可以選擇性地在Foxp3表達的Treg細胞中誘導穩(wěn)定表達熒光tdTomato）與XCR1-Venus/WT cDC1報告小鼠進行雜交。將OT-1 T細胞轉(zhuǎn)移到這些小鼠中，在VV-OVA感染后第3天，OT-1 T細胞在富含DC的樞紐中停滯（圖1O）。相比之下，在相同微環(huán)境中檢測到的Treg細胞并未停滯，而是保持了平均速度為8 mm/min的隨機遷移活動，就像在穩(wěn)態(tài)期間一樣。這種Treg細胞的行為與抗原特異性CD8 T細胞（遷移停滯）和抗原特異性CD4 T細胞（交替停止和移動）不同（圖1P）。值得注意的是，在T細胞啟動的初始階段，即感染的第一天，Treg細胞也未遷移停滯（圖S1，N和O）。作者考慮了只有Treg細胞的一個亞群可能被特異性吸引到CD8 T細胞被保留的亞濾泡樞紐的可能性。

3 CXCR3促進IL-2的獲取并促進CD8 T細胞效應子的構建，發(fā)生在獨立的啟動階段

         在抗原特異性細胞相互作用期間，免疫突觸的形成需要鈣離子（Ca2+）的動員。相應地，T細胞從DCs的分離和細胞周期的啟動依賴于T細胞受體（TCR）的脫敏，并且與受損的Ca2+信號傳導相關。作者分離體內(nèi)通過VV-GP激活的抗原特異性P14 T細胞，并在體外測量其對硫代硫酸鈉的Ca2+流入反應（硫代硫酸鈉會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存耗竭，進而激活細胞外Ca2+流入）。在感染后24小時、48小時以及72小時分離的激活P14 T細胞顯示出對硫代硫酸鈉的Ca2+流入反應，這種反在添加細胞外Ca2+后進一步增加（圖2A）。這些結果表明，至少有一部分T細胞在初始激活后保留了動員Ca2+的能力——暗示其對TCR刺激能夠持續(xù)或再次獲得反應性的潛力。這是作者觀察到的第二次啟動階段中細胞停滯的關鍵，并且與其他研究中使用肽脈沖DCs的結果形成對比。為了進行體內(nèi)分析，作者構建了表達遺傳編碼的Ca2+傳感器GCaMP6F的P14 T細胞，并在第3天使用活體顯微鏡（IVM）進行分析。作者發(fā)現(xiàn)，在亞濾泡生態(tài)位中停滯的P14 T細胞顯示出振蕩的熒光信號，表明Ca2+通量（圖2，B和C），這與TCR信號傳導一致。

         接下來，作者研究了哪種趨化因子受體可能參與將T細胞帶到與DCs接近的位置，并促進更長期的接觸。其中CXCR3在T細胞激活后的第2天至第3天表達上調(diào)。作者將WT[綠色熒光蛋白（GFP）]和CXCR3基因敲除（KO）OT-1 T細胞（用tdTomato標記）轉(zhuǎn)移到WT受體中，用VV-OVA感染它們，并在3天后分析其在組織切片中的定位（使用共聚焦顯微鏡）。基于它們的空間積累或與淋巴結被膜的距離，WT和CXCR3 KO OT-1 T細胞在引流淋巴結中的整體分布相似，但它們的動態(tài)行為可能不同。因此，作者在相同條件下應用IVM直接比較WT和CXCR3 KO OT-1 T細胞的遷移行為，發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO和WT細胞聚集在一起；然而，遷移停滯的CXCR3 KO細胞的比例低于WT OT-1 T細胞（圖2，D到H）。同樣，WT OT-1 T細胞的平均速度和軌跡位移長度也低于CXCR3 KO OT-1 T細胞（圖2，E和F）。此外，少數(shù)停滯的CXCR3 KO細胞平均停滯時間更短（圖2G）。作者發(fā)現(xiàn)，在檢測到OT-1 T細胞簇的區(qū)域，CXCR3 KO T細胞的數(shù)量比其WT對應細胞少約三倍（圖2H）。IVM分析顯示，WT與CXCR3 KO OT1 T細胞的總體豐度相似（圖2H）。這些結果說明CXCR3并不調(diào)節(jié)激活的CD8 T細胞的整體分布，而是影響它們在特定亞濾泡樞紐中的募集和/或保留。

         為此作者重新分析了WT和CXCR3 KO OT-1細胞在組織切片上的分布。作者將WT和CXCR3 KO OT-1 T細胞轉(zhuǎn)移，并用VV-OVA和VV-GP感染小鼠。在分析前8小時，作者轉(zhuǎn)入了一組新的抗原特異性幼稚SMARTA T細胞作為細胞探針，以揭示激活的OT-1 T細胞被保留的生態(tài)位（圖2I）。具體來說，作者使用激活的（CD69+）SMARTA T細胞作為參考點，并在淋巴結組織切片的共聚焦圖像上測量WT和CXCR3 KO OT-1 T細胞的距離。與IVM結果相符，作者發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO T細胞比其WT對應細胞參考點更遠（圖2J）。這些結果表明，在第二次啟動階段，CXCR3促進了激活的CD8 T細胞在特定亞濾泡樞紐中的獲取和細胞停滯。

         接下來，為了探究感染后第3天CXCR3依賴的相互作用期間傳遞了哪些信號，作者在感染第8天分析CD8 T細胞，發(fā)現(xiàn)此時CD8 T細胞已完全分化為效應T細胞（Teff）。與已發(fā)表的結果一致，作者發(fā)現(xiàn)CXCR3 KO CD8 T細胞未能在感染后第8天在淋巴結中通過Killer細胞凝集素樣受體G1（KLRG1）表達分化為Teff（圖2，K到M）。IL-12作為信號3細胞因子，指導CD8 T細胞分化，并且能夠產(chǎn)生IL-12的細胞可以通過使用將黃色熒光蛋白（YFP）表達與p40亞基（IL-12p40-IRES-eYFP）偶聯(lián)的小鼠來檢測。在IL-12p40-IRES-eYFP小鼠中，表達YFP的cDC1s在相關生態(tài)位中富集，并在第3天與激活的OT-1相互作用（圖S2，H到J）。作者前期工作已經(jīng)證明cDC1s對于CD8 T細胞記憶構建至關重要，但并非Teff細胞分化所必需。對XCR1WT/DTR（DTR，白喉毒素受體）小鼠進行白喉毒素處理效果理想，導致cDC1s減少了98%。然而，cDC1耗竭并未阻止CD8 T細胞在第3天停滯，表明在這一啟動階段，cDC1和IL-12信號傳導是冗余的。

         因此，作者將注意力轉(zhuǎn)向調(diào)節(jié)CD8 T細胞分化的重要因子IL-2，并探究這種細胞因子是否在通過CXCR3獲取的細胞樞紐中被感知。作者將WT和CXCR3 KO OT-1 T細胞共同轉(zhuǎn)移到WT受體中，用VV-OVA感染它們，并在感染后第3天，通過流式細胞術分析信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子5（pSTAT5）的磷酸化，作為IL-2信號傳導的衡量標準。作者發(fā)現(xiàn)與WT OT-1 T細胞相比，CXCR3 KO細胞中的pSTAT5水平降低（圖2，N和O）。

         CD8 T細胞的增殖能力與T細胞因子1（TCF1）蛋白的表達相關，該蛋白由Tcf7基因編碼。因此，作者探究了是否主要表達低或高TCF1水平的CD8 T細胞母細胞獲得了對富含IL-2的生態(tài)位的訪問。在感染后第3天，作者發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移的P14 TCF7GFP細胞中，pSTAT5陽性細胞的比例在TCF1低細胞中高于TCF1高細胞，這與TCF1低細胞中CXCR3、CD25和TCRβ的高表達水平一致（圖2，P到R）。然而，由于作者無法在IVM期間區(qū)分轉(zhuǎn)移的P14 TCF7GFP細胞中的TCF1低和TCF1高細胞，因此尚需確定在這一獨特的啟動階段，CD8 T細胞在哪個特定的分化階段重新與DCs相互作用。總的來說，作者的結果表明，CD8 T細胞表達的CXCR3通過在第二次啟動階段優(yōu)化對亞濾泡生態(tài)位中IL-2的訪問，促進了Teff的構建。

圖2：CXCR3提供對IL-2的訪問，并促進CD8 T細胞效應子的構建，發(fā)生在獨立的啟動階段

4 Treg細胞動態(tài)調(diào)控CD8 T細胞效應子的構建，但獨立于CXCR3

         Treg細胞通過限制IL-2來部分調(diào)控抗病毒適應性免疫反應，從而抑制CD8 T細胞的擴增和Teff分化。利用Foxp3-DTR小鼠耗竭Treg細胞后，在VV-OVA感染后第8天，病毒特異性、VVB8R四聚體結合的CD8 T細胞中表達Teff細胞標記物KLRG1的比例增加（圖3A）。同時，如果在初始啟動階段后24小時耗竭Treg細胞，這些病毒特異性CD8 T細胞的絕對數(shù)量也會增加（圖3B）。當在感染后48小時耗竭Treg細胞時，也觀察到了這種效應，表明Treg細胞的調(diào)控與CD8 T細胞在淋巴結中的第二次啟動階段在時間上有所重疊。一致地，感染后48小時耗竭Treg細胞會導致在VV-OVA感染后第3天過繼轉(zhuǎn)移的OT-1 T細胞中pSTAT5水平增加（圖3C）。這些數(shù)據(jù)說明，Treg細胞通過減少IL-2的可用性來抑制CD8 T細胞的增殖和分化。值得注意的是，與OT-1 T細胞相比，Treg細胞的pSTAT5水平較低，這與其在富含IL-2的生態(tài)位中停留時間較短的結果一致（圖1，O和P）。

         由于抗病毒CD8 T細胞需要CXCR3才能與輔助性CD4 T細胞在亞濾泡簇中共定位，作者研究了Treg細胞表達CXCR3是否是限制CD8 T細胞分化的必要條件，通過感染CXCR3ΔFoxp3（Foxp3Cre × Cxcr3fl/fl）小鼠進行實驗。與WT小鼠相比，感染后第8天，表達KLRG1的CD8 T細胞的比例以及VVB8R四聚體結合的CD8 T細胞的總數(shù)均未發(fā)生改變（圖3，D和E）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，Treg細胞對病毒特異性CD8 T細胞反應的調(diào)控并不需要CXCR3的表達。只有部分Treg細胞磷酸化STAT5的觀察結果，提示在感染后第3天，特定亞群的Treg細胞可能在這些相互作用中調(diào)控CD8 T細胞。

         為了解析Treg細胞的異質(zhì)性和激活程序，作者從未感染和VV-OVA感染的Foxp3-GFP小鼠的淋巴結中分選Treg細胞，然后進行標記和混合，以便進行scRNA-seq。在穩(wěn)態(tài)下，作者檢測到三個不同的Treg細胞簇，相應地，在感染后也檢測到三個簇，以及一個混合簇（圖3F）。作者將其中一個簇命名為效應Treg（eTreg）細胞，其特征是表達Cd44、Icos、Tnfrsf9以及多種趨化因子受體，如Cxcr3和Ccr2（圖3G）。在穩(wěn)態(tài)下，該簇在與IL-2依賴通路相關的基因表達評分中最高（圖3H）。另外兩個獨立的簇表達Sell（CD62L）、Ccr7和Klf2，并且IL-2信號評分較低，因此作者將其稱為靜止Treg（rTreg）細胞（圖3，G和H）。最后，剩余的簇具有混合特征，其特征是表達Cd69和Nr4a1，表明存在活躍的TCR信號傳導（圖3G）。總體而言，感染后，Treg細胞的Ifit3和Socs1表達增加，說明IFN-γ和IL-2依賴通路的激活增加（圖3，H到K）。值得注意的是，與IFN信號相關的基因表達相比，感染后IL-2信號相關基因表達的增加主要出現(xiàn)在rTreg細胞中（圖3，G和H）。從成像（圖1O）和功能數(shù)據(jù)（圖3，A到E）來看，Treg細胞在感染后被全局激活，并獨立于CXCR3進入相關生態(tài)位的途徑。從功能上講，Treg細胞似乎限制了IL-2的總體豐度，從而限制其可用性。相應地，在缺乏Treg細胞的情況下，CXCR3基因敲除（KO）OT-1 T細胞的Teff細胞構建得以恢復，這表現(xiàn)為在VV-OVA感染后，相對數(shù)量以及在較小程度上絕對數(shù)量的KLRG1表達細胞增加（圖3L）。然而，IL-2的可用性在多大程度上受到Treg細胞在這些亞濾泡啟動樞紐內(nèi)外的調(diào)控仍不清楚。因此，作者得出結論，促進CD8 T細胞效應子構建的第二次啟動階段受到Treg細胞的限制，而Treg細胞動態(tài)地穿越生態(tài)位且獨立于CXCR3。

圖3：Treg細胞動態(tài)調(diào)控CD8 T細胞效應子的構建，但獨立于CXCR3

5 CD4 T細胞提供旁分泌IL-2以促進CD8 T細胞效應子的分化和擴增

         為了確定第二次啟動階段中IL-2的細胞來源，作者構建了IL2ΔCD8（CD8aCre × Il2fl/fl）小鼠，并在VV-OVA感染后第8天分析了VVB8R四聚體結合的CD8 T細胞。在CD8 T細胞無法產(chǎn)生IL-2的小鼠中，作者沒有觀察到Teff構建的差異， CD8 T細胞數(shù)量和表達KLRG1及CX3CR1的細胞比例沒有變化（圖4，A到C）。

         接下來，作者將注意力集中在CD4 T細胞上，認為它們可能是亞濾泡區(qū)域中傳遞的旁分泌IL-2的潛在來源。在通過抗體介導耗竭CD4 T細胞后，作者在感染后第3天觀察到轉(zhuǎn)移的OT-1 T細胞中pSTAT5水平降低（圖4D）。然而，在其他研究中，CD4 T細胞耗竭對急性抗病毒CD8 T細胞反應的影響較小。這些觀察結果與IL-2Rα缺陷（CD25 KO）OT-1 T細胞的CD8 T細胞擴增和效應分化顯著減少形成對比（圖4，E到G），這提示CD4輔助T細胞可能產(chǎn)生冗余的IL-2。

         目前用于評估CD4 T細胞輔助作用的模型（例如MHC-II缺陷或抗體介導的CD4 T細胞耗竭）并不具有細胞類型特異性，會導致同時丟失具有抑制作用的CD4表達的Treg細胞。為了選擇性地耗竭CD4輔助T細胞（CD4help），同時保持Treg細胞群完整，作者構建了CD4-DTR小鼠，其中DTR由兩個loxP位點包圍，并將其與Foxp3Cre ERT2小鼠雜交（此后稱為CD4help-DTR）。經(jīng)過他莫昔芬處理后，Cre介導的重組在Treg細胞中切除DTR，從而在白喉毒素（DT）給藥后使它們免于細胞死亡（圖4，H和I）。事實上，在VV感染后第8天，WT和CD4-DTR小鼠中VVB8R四聚體陽性的CD8 T細胞的絕對數(shù)量相似，這些小鼠中同時耗竭了輔助性和調(diào)節(jié)性CD4 T細胞。相比之下，使用CD4help-DTR小鼠選擇性耗竭CD4輔助T細胞后，病毒特異性CD8 T細胞的數(shù)量減少了五倍以上（圖4J）。此外，在CD4-DTR和CD4help-DTR小鼠中，KLRG1+或CX3CR1+ VVB8R四聚體陽性Teff細胞的頻率降低（圖4，K和L），并且它們的絕對數(shù)量在CD4help-DTR小鼠中進一步減少。這些數(shù)據(jù)確立了CD4輔助細胞已知記憶細胞功能外的在決定急性抗病毒CD8 T細胞反應數(shù)量中的作用。此外，這些結果還暗示Treg細胞可以在沒有CD4輔助T細胞的情況下發(fā)揮抑制作用。

圖4：CD4 T細胞提供旁分泌IL-2以促進CD8 T細胞效應子的分化和擴增

6 CD8 T細胞第二次啟動階段的親和力選擇

         作者的研究結果揭示了一個獨特的T細胞啟動階段，該階段負責將CD4輔助T細胞產(chǎn)生的旁分泌IL-2傳遞給CD8 Teff，以調(diào)控其分化和擴增。這些發(fā)現(xiàn)與調(diào)節(jié)B細胞及其在生發(fā)中心反應期間的克隆選擇以實現(xiàn)親和力成熟的CD4 T細胞輔助功能存在相似之處。因此，作者研究了CD8 T細胞的第二次啟動階段是否也可能類似地用于選擇高親和力的CD8 T細胞克隆以進一步擴增。為了驗證這一假設，作者將低親和力的OVA257特異性CD8 T細胞（OT-3）與它們的高親和力對應細胞（OT-1）的動態(tài)行為進行了比較。在VV-OVA感染后第1天，對淋巴結濾泡間區(qū)域（IFA）的活體顯微鏡（IVM）觀察顯示，在初始啟動階段，OT-1和OT-3 T細胞的遷移停滯并共同聚集（圖5，A到D）。通過共聚焦顯微鏡對淋巴結切片的連續(xù)分析證實了這一結果，OT-1和OT-3 T細胞均表達CD69，說明這兩種細胞通過TCR介導被激活（圖5E）。

         已有研究表明，T細胞受體（TCR）親和力控制T細胞與樹突狀細胞（DC）相互作用的持續(xù)時間，作者也觀察到T細胞與DC相互作用的動態(tài)存在細微差異（圖5B）。然而，OT-1和OT-3細胞以相似的方式增殖（圖5F），并在第3天在淋巴結中達到了相當?shù)慕^對數(shù)量（圖5G）。

         接下來，作者通過將OT-3 T細胞與OT-1 T細胞在同一個淋巴結中直接比較，分析了OT-3 T細胞在第二次啟動階段的動態(tài)行為。與OT-1 T細胞不同，低親和力的OT-3 T細胞未能與DC進行長期重新相互作用（圖5，I到L）。一致地，盡管CD25水平相似，但在感染后第3天，OT-3 T細胞中pSTAT5陽性的比例低于OT-1 T細胞（圖5，M和N），證實了OT-3 T細胞對富含IL-2的生態(tài)位的訪問受限。為了測試由這些生態(tài)位中的DC網(wǎng)絡調(diào)控屬于細胞內(nèi)在還是細胞外在，作者在感染后第3天將幼稚的OT-1和OT-3 T細胞轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，并分析它們的激活模式和定位。轉(zhuǎn)移后8小時，作者通過CD69上調(diào)檢測到幼稚OT-3 T細胞的強烈激活，盡管其頻率低于OT-1 T細胞（圖5O）。值得注意的是，在組織切片上，OT-1和OT-3 T細胞在淋巴結的相同生態(tài)位中共同聚集（圖5P）。這些結果表明，低親和力T細胞在第二次啟動階段未能積累相同水平的IL-2信號，這是由于它們在初始激活后基于TCR的遷移停滯能力發(fā)生了改變。與之相關的是，在感染后第8天檢測到的OT-3 T細胞數(shù)量比OT-1 T細胞減少了10倍以上（圖5Q）。同樣，OT-3 T細胞的Teff構建，以表達KLRG1和CX3CR1的細胞比例為指標，也低于OT-1 T細胞（圖5，R和S），并且其數(shù)量減少了100倍以上。Treg細胞耗竭并不能在感染后增加OT-3細胞的總數(shù)，但確實增加了其中Teff細胞的比例。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)與以下觀點一致：第二次啟動階段的作用是選擇高親和力的CD8 T細胞克隆，以通過CD4 T細胞衍生的IL-2信號進一步擴增和分化。

圖5：在時間上分離的CD8 T細胞啟動階段的親和力選擇

結論：

         綜上所述，作者研究揭示了CD8 T細胞在免疫反應中的兩個啟動階段，其中第二階段通過CD4 T細胞提供的IL-2信號和Treg細胞的調(diào)節(jié)作用，選擇性地促進高親和力CD8 T細胞的擴增和分化，為疫苗和免疫療法的開發(fā)提供了新機制和靶點。

實驗方法：

         活體成像技術（IVM），流式細胞術，細胞遷移模式分析，scRNA-seq，免疫熒光，細胞培養(yǎng)

參考文獻：

         Jobin K, Seetharama D, Rüttger L, Fenton C, Kharybina E, Wirsching A, Huang A, Kn?pper K, Kaisho T, Busch DH, Vaeth M, Saliba AE, Graw F, Pulfer A, González SF, Zehn D, Liang Y, Ugur M, Gasteiger G, Kastenmüller W. A distinct priming phase regulates CD8 T cell immunity by orchestrating paracrine IL-2 signals. Science. 2025 Apr 11;388(6743):eadq1405. doi: 10.1126/science.adq1405. Epub 2025 Apr 11. PMID: 40208984.