腫瘤源性外泌體LINC01812誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)膽管癌的神經(jīng)周圍浸潤

         M2型巨噬細(xì)胞在侵襲性實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們與神經(jīng)周圍浸潤（PNI）密切相關(guān)，且常與不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)。在此背景下，腫瘤源性外泌體是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)。然而，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞與膽管癌中的PNI之間的關(guān)系尚未得到探究。在本研究中，我們運(yùn)用多重免疫熒光和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，證明了LINC01812在膽管癌組織中表達(dá)上調(diào)，且其與M2型巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)。外泌體lncRNA測序、外泌體攝取實(shí)驗(yàn)、RNA下拉實(shí)驗(yàn)以及質(zhì)譜分析表明，巨噬細(xì)胞能夠攝取含有LINC01812的外泌體，并促進(jìn)膽管癌細(xì)胞向M2型表型轉(zhuǎn)化。此外，腫瘤微環(huán)境可通過M2型巨噬細(xì)胞顯著增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤能力。本研究結(jié)果表明，源自膽管癌的含LINC01812的外泌體可誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，并促進(jìn)神經(jīng)浸潤，從而為治療膽管癌中的PNI提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2025年3月發(fā)表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）CCA不同浸潤階段M1/M2巨噬細(xì)胞密度

         我們采用多重?zé)晒馊旧夹g(shù)，檢測了CD68、iNOS和CD206之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞呈廣泛陽性信號(hào)，且在腺體組織中顯著聚集。相比之下，M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤侵襲前沿的微環(huán)境中分布更為彌散。為驗(yàn)證免疫熒光染色結(jié)果，我們對(duì)iNOS和CD206的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞密度進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中iNOS的熒光強(qiáng)度和M1型巨噬細(xì)胞的密度均顯著降低，而CD206的熒光強(qiáng)度和M2型巨噬細(xì)胞的密度則顯著升高（圖1A）。隨后，我們對(duì)12例膽管癌（CCA）患者的樣本進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序。我們與exoRbase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了聯(lián)合分析，并鑒定出76個(gè)差異上調(diào)的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖1B和C）。其中，LINC01812尤為引人關(guān)注，因?yàn)樗谀懝馨┙M織中的表達(dá)顯著升高，且在膽管癌患者來源的外泌體中富集，提示其在腫瘤-免疫細(xì)胞通訊中可能發(fā)揮作用。我們觀察到LINC01812的表達(dá)與M2型巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，與M1型巨噬細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)，這支持了其可能參與免疫細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)（圖1D）。此外，我們利用公共數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了LINC01812與M2型巨噬細(xì)胞之間的正相關(guān)性（圖1E）。此外，我們證實(shí)了LINC01812高表達(dá)患者的基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分顯著高于LINC01812低表達(dá)患者（圖1F）。基于這些結(jié)果，我們選擇LINC01812進(jìn)行進(jìn)一步研究，以闡明其在膽管癌中的功能作用和分子機(jī)制。

2）THP-1細(xì)胞外泌體的分離、表征和攝取

         TEM圖像顯示，外泌體呈現(xiàn)出典型的杯狀形態(tài)（圖2A）。NTA顯示，分離得到的外泌體的平均直徑約為110 nm，與典型外泌體的特征一致（圖2B）。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外泌體標(biāo)志物（包括Alix、HSP70、TSG101、CD81）以及陰性標(biāo)志物calnexin的表達(dá)（圖2C）。共聚焦顯微鏡顯示，隨時(shí)間推移，積累在THP-1細(xì)胞周圍的外泌體數(shù)量顯著增加（圖2D）。用于分析外泌體中LINC01812表達(dá)的exoRbase數(shù)據(jù)庫顯示，其在膽汁、食管鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤中的表達(dá)水平升高（圖2E）。此外，腫瘤患者血液、尿液和膽汁樣本中的LINC01812表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組（圖2F）。

3）LINC01812促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

         為探究LINC01812在CCA中的功能作用，我們首先評(píng)估了其在HIBEPIC、HUCCT1、QBC939、RBE和HCCC9810細(xì)胞中的表達(dá)水平（圖3A）。根據(jù)qPCR分析結(jié)果，選擇RBE細(xì)胞系進(jìn)行LINC01812敲低實(shí)驗(yàn)，并利用慢病毒載體在HUCCT1細(xì)胞中建立了LINC01812的穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系（圖3B和C）。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC01812敲低顯著抑制了RBE細(xì)胞的增殖（圖3D和E）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，LINC01812敲低顯著降低了CCA細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖3F和G）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LINC01812敲低后細(xì)胞凋亡顯著增加。相反，在HUCCT1細(xì)胞中過表達(dá)LINC01812則產(chǎn)生了與敲低相反的效果；LINC01812過表達(dá)顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖（圖3D）、遷移和侵襲（圖3F和G）；此外，還降低了細(xì)胞凋亡率。

4）CCA細(xì)胞外泌體衍生的LINC01812誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

         通過FISH技術(shù)檢測了LINC01812在CCA細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，LINC01812主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。采用Transwell共培養(yǎng)模型將HUCCT1細(xì)胞與M0型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)（圖4B和D）。與LINC01812過表達(dá)的HUCCT1細(xì)胞共培養(yǎng)后，M0型巨噬細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)。Western blot分析證實(shí)，在此共培養(yǎng)條件下，M0型巨噬細(xì)胞發(fā)生了M2型極化（圖4C）。僅與外泌體共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，Lenti-oe-LINC01812-exo顯著誘導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞分化為M2型而非M1型巨噬細(xì)胞（圖4E和G）。此外，添加外泌體抑制劑GW4869顯著抑制了CCA細(xì)胞來源的外泌體誘導(dǎo)的M0型巨噬細(xì)胞極化。qPCR證實(shí)，M2型巨噬細(xì)胞中LINC01812的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4F）。在裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中，研究了外泌體來源的LINC01812在CCA體內(nèi)的作用（圖4H）。結(jié)果顯示，與NC-exo組相比，Lenti-oe-LINC01812-exo組的腫瘤體積和重量顯著增加；而NC-exo組的腫瘤大小和重量相對(duì)于PBS組也顯著增加（圖4I、J、4K）。

5）外泌體LINC01812通過與TUBB4B相互作用促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化

         我們使用生物素標(biāo)記的LINC01812探針或陰性對(duì)照（NC）探針與來自THP-1 M0型巨噬細(xì)胞的總蛋白提取物進(jìn)行孵育，以探究LINC01812的作用機(jī)制。利用鏈霉親和素磁珠進(jìn)行下拉分析后，通過SDS-PAGE分離蛋白產(chǎn)物（圖5A）。采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)鑒定LINC01812結(jié)合蛋白，并選取至少兩條獨(dú)特鑒定的肽段進(jìn)行進(jìn)一步分析。候選蛋白包括TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1。利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫的單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）中的巨噬細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行表征。首先，將所有細(xì)胞聚類為六個(gè)亞群（圖5D），并將髓系亞群進(jìn)一步重新聚類為單核細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞（圖5E）。隨后，我們分析了重新聚類的巨噬細(xì)胞亞群中TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與鄰近組織相比，TUBB4B和HSPD1在癌組織中顯著高表達(dá)，而PGAM2的表達(dá)無顯著差異。因此，我們對(duì)剩余五個(gè)基因進(jìn)行了擬時(shí)序分析。擬時(shí)序分析用于模擬CCA中髓系細(xì)胞的分化過程（圖5G和H），結(jié)果顯示單核細(xì)胞處于分化的早期階段；經(jīng)過分支點(diǎn)4后，它們逐漸分化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。隨后，我們分析了這些結(jié)合蛋白在M2型巨噬細(xì)胞分化擬時(shí)序軌跡上的表達(dá)趨勢（圖5I）。結(jié)果表明，TUBB4B是LINC01812調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵基因。分析了TUBB4B高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的配體-受體介導(dǎo)的細(xì)胞相互作用（圖5J）。Western blot分析驗(yàn)證了TUBB4B與LINC01812之間的相互作用（圖5C），二級(jí)質(zhì)譜圖如圖5B所示。

6）外泌體LINC01812通過結(jié)合TUBB4B調(diào)控Notch通路

         與鄰近的非癌組織相比，在12例CCA樣本和TCGA數(shù)據(jù)庫的腫瘤組織中，LINC01812和TUBB4B均顯著上調(diào)（圖6A）。在TCGA-CHOL隊(duì)列中，LINC01812的高表達(dá)與較差的總生存率相關(guān)；然而，TUBB4B的表達(dá)并未顯示出顯著的預(yù)后差異（圖6B）。隨后，我們進(jìn)行了原位雜交和雙重免疫熒光染色，以確定LINC01812和TUBB4B在CCA組織中的共定位情況。我們還使用免疫熒光技術(shù)分析了TUBB4B和M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物CD206的定位情況。結(jié)果顯示，LINC01812和TUBB4B在腫瘤組織中共定位（圖6C）。然而，由于CD206在腫瘤組織中廣泛分布，TUBB4B與CD206的共定位并不顯著。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC01812和TUBB4B的表達(dá)水平之間可能存在相關(guān)性。對(duì)來自患者的40例CCA組織樣本進(jìn)行的qPCR驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖6E）。在THP-1 M0型巨噬細(xì)胞中過表達(dá)LINC01812可增加TUBB4B的表達(dá)（圖6D）。我們用放線菌素D處理了LINC01812過表達(dá)和敲低的M0型巨噬細(xì)胞，以探究LINC01812在調(diào)控TUBB4B中的作用。如圖6F所示，在放線菌素D處理下，LINC01812過表達(dá)顯著增加了TUBB4B的mRNA表達(dá)。相反，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，LINC01812的敲低導(dǎo)致TUBB4B表達(dá)顯著降低（圖6F）。利用siRNA轉(zhuǎn)染THP-1來源的M0型巨噬細(xì)胞，以敲低TUBB4B。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行RNA測序分析，鑒定出1626個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）（圖6G）。GSEA顯示，在TUBB4B過表達(dá)組中，Notch通路基因集的表達(dá)水平較高（圖6H）。Western blot分析顯示，與NC組相比，在Lenti-oe-LINC01812過表達(dá)組中，TUBB4B和Notch通路成分（包括c-Myc、Hes1、Notch1和Notch3）的表達(dá)顯著增加（圖6I）。LINC01812誘導(dǎo)的Notch通路激活依賴于TUBB4B的表達(dá)，且敲低TUBB4B可有效阻斷LINC01812誘導(dǎo)的Notch通路激活。這表明LINC01812與TUBB4B之間存在線性調(diào)控軸（圖6J）。最后，流式細(xì)胞術(shù)顯示，與NC組相比，用Lenti-oe-LINC01812-exo處理的M0型巨噬細(xì)胞顯著向M2表型分化；然而，在M0型巨噬細(xì)胞中敲低TUBB4B顯著抑制了Lenti-oe-LINC01812-exo的作用（圖6K）。

7）外泌體LINC01812通過誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)PNI

         外泌體可被神經(jīng)元細(xì)胞攝取，并影響特定神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。因此，我們?cè)u(píng)估了在不同處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞的分化水平以及四種特定神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌情況。外泌體可促進(jìn)低分化PC12細(xì)胞的分化，而Lenti-oe-LINC01812-exo可進(jìn)一步增強(qiáng)這種效果。與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可放大分化效應(yīng)，使分化水平顯著升高（圖7A）。qPCR結(jié)果顯示，與NC-exo處理組相比，經(jīng)Lenti-oe-LINC01812-exo處理的PC12細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌水平略有增加，盡管差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；然而，當(dāng)PC12細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，這種效應(yīng)顯著增強(qiáng)（圖7B）。我們建立了體外CCA周圍神經(jīng)浸潤（PNI）模型，通過觀察CCA細(xì)胞在基質(zhì)膠中的遷移情況，進(jìn)一步探索外泌體的作用。外泌體可促進(jìn)CCA細(xì)胞向背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的侵襲。與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著增強(qiáng)這種侵襲能力，而預(yù)先用GW4869處理CCA細(xì)胞則可有效抑制這一過程（圖7C）。這表明外泌體LINC01812和M2型巨噬細(xì)胞可以通過獨(dú)立和協(xié)同機(jī)制促進(jìn)PNI。TCGA-CHOL數(shù)據(jù)顯示，PNI患者的LINC01812表達(dá)水平顯著升高（圖7D）。在確認(rèn)巨噬細(xì)胞中的Notch通路可被外泌體LINC01812激活后，我們進(jìn)行了ELISA以測量巨噬細(xì)胞上清液中CCL2的表達(dá)水平。經(jīng)Lenti-oe-LINC01812-exo處理后，CCL2表達(dá)增加了約五倍。相比之下，經(jīng)NC-exo處理的巨噬細(xì)胞中CCL2表達(dá)僅增加了1.6倍，這可能是由于其他補(bǔ)償機(jī)制對(duì)CCL2的調(diào)控所致（圖7E）。此外，本研究的作用機(jī)制示意圖如圖7F所示。

結(jié)論：

         本研究證明，CCA細(xì)胞來源外泌體可通過LINC01812-Notch-CCL2軸介導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化并促進(jìn)神經(jīng)浸潤。這一過程形成了有利于腫瘤侵襲的免疫微環(huán)境，并突顯了LINC01812作為膽管癌神經(jīng)浸潤預(yù)測生物標(biāo)志物的潛力。

實(shí)驗(yàn)方法：

         qPCR，CCK8，傷口愈合試驗(yàn)，Transwell，流式，FISH，Western blotting，RNA pull-down。

參考文獻(xiàn)：

         Wang Q, Sun Z, Guo J, Li H, Zhang J, Zhang B, Zhou B, Feng Y. Tumor-derived exosomal LINC01812 induces M2 macrophage polarization to promote perineural invasion in cholangiocarcinoma. Cancer Lett. 2025 May 1;617:217596. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217596.