YTHDF1/RNF7/p27軸促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展

         前列腺癌（PCa）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是男性最常見的癌癥。在本研究中，我們證明了YTHDF1在PCa癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。YTHDF1敲除通過蛋白酶體降解信號(hào)減少p27蛋白穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和異種移植腫瘤形成。一致地，YTHDF1耗盡顯著減少了Pten或/和TP53缺陷類器官的克隆生長(zhǎng)。RNF7是YTHDF1的直接下游靶點(diǎn)。RNF7的高翻譯導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制劑p27的有效降解和惡性腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)。此外，我們提供了證據(jù)表明YTHDF1或RNF7耗盡通過增加細(xì)胞凋亡使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑敏感。我們的研究結(jié)果揭示了neddylation抑制劑MLN4924在體外和體內(nèi)有效抑制前列腺癌進(jìn)展。我們的研究強(qiáng)調(diào)了YTHDF1/RNF7/p27軸是PCa的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，表明其作為新治療靶點(diǎn)的潛力。本文于2025年4月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）YTHDF1在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)

         通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的全面分析，我們觀察到YTHDF1在各種腫瘤類型中高表達(dá)，包括前列腺癌（圖1A）。隨后的分析顯示，與對(duì)照（鄰近或癌旁）組織相比，前列腺癌組織中YTHDF1的表達(dá)顯著升高（圖1B，C）。此外，YTHDF1的升高表達(dá)與患者較差的預(yù)后顯著正相關(guān)（圖1D）。ROC曲線分析顯示，YTHDF1的AUC值為0.749，表明其作為前列腺癌獨(dú)立生物標(biāo)志物的潛力（圖1E）。此外，YTHDF1與前列腺癌的分期相關(guān)（圖1F，G）。同時(shí)，我們的組織微陣列分析顯示，YTHDF1在前列腺癌組織中顯著過表達(dá)（圖1H，I）。我們的研究結(jié)果表明，與正常前列腺細(xì)胞RWPE-1相比，YTHDF1在前列腺癌細(xì)胞系PC3，DU145，22RV-1和LNCaP中顯著過表達(dá)（圖1J，K）。我們?cè)?span>DU145和22RV-1中創(chuàng)建了YTHDF1敲低細(xì)胞系，證明YTHDF1敲低顯著減少了腫瘤細(xì)胞增殖（圖1L–P）。

2）YTHDF1調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變

         鑒于YTHDF1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，我們發(fā)現(xiàn)通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)（圖2A，B）沉默YTHDF1有效地破壞了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，YTHDF1敲低導(dǎo)致細(xì)胞周期在G0/G1期停滯（圖2C）。檢測(cè)參與G0/G1期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)p27蛋白顯著上調(diào)，而CDK2、CDK4和CDK6蛋白沒有顯著變化（圖2D）。此外，我們?cè)谌苏Ｇ傲邢?span>RWPE-1細(xì)胞中過表達(dá)YTHDF1，并評(píng)估其潛在的致癌效應(yīng)，結(jié)果表明YTHDF1強(qiáng)制表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞增殖（圖2E–I）。在體外證實(shí)YTHDF1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖后，我們?cè)u(píng)估了其在體內(nèi)的效應(yīng)。最初，我們利用小鼠前列腺癌類器官，研究結(jié)果顯示敲低小鼠YTHDF1顯著減少了Pten-或/和TP53缺陷類器官的克隆形成（圖2J–M）。同時(shí)，在裸鼠中進(jìn)行異種移植腫瘤形成的實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF1敲低顯著延緩了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)（圖2N）。異種移植腫瘤表型進(jìn)一步通過YTHDF1敲低后腫瘤體積的減少得到證實(shí)（圖2O），并通過IHC染色確定Ki67染色陽性率顯著降低（圖2P–Q）。

3）YTHDF1提高了RNF7轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率

         為了進(jìn)一步闡明p27的上調(diào)是否是YTHDF1敲低后抑制腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素，我們?cè)?span>YTHDF1敲低的指示細(xì)胞中進(jìn)行了p27的進(jìn)一步敲低，并發(fā)現(xiàn)p27敲低抵消了YTHDF1的效果（圖3A–B）。值得注意的是，YTHDF1敲低后p27的RNA水平?jīng)]有顯著變化?？紤]到YTHDF1不與p27轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，我們假設(shè)YTHDF1通過其他介質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后水平減少p27蛋白表達(dá)。因此，將放線菌酮（CHX）引入細(xì)胞中，結(jié)果顯示YTHDF1敲低組中p27蛋白的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)（圖3C）。此外，我們發(fā)現(xiàn)只有蛋白酶體降解信號(hào)抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑CQ（氯喹），能夠逆轉(zhuǎn)YTHDF1過表達(dá)和敲低細(xì)胞中p27蛋白的減少，這表明YTHDF1通過增強(qiáng)p27蛋白的泛素降解來促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程（圖3D）。因此，我們?cè)u(píng)估了前列腺癌細(xì)胞中p27的泛素化狀態(tài)，并觀察到YTHDF1敲低后其泛素化水平顯著降低（圖3E）。我們分析了已知靶向p27的E3泛素連接酶的表達(dá)，如CUL1、SKP1和SKP2。在YTHDF1敲低的腫瘤細(xì)胞中，只有RNF7，是E3泛素連接酶RBX/ROC RING的一個(gè)關(guān)鍵亞單位，對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，與對(duì)照細(xì)胞相比顯著減少。同時(shí)，CUL1、SKP1和SKP2的水平保持不變（圖3F），而RNF7的mRNA幾乎沒有變化。重要的是，我們使用m6A Atlas數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)了RNF7 mRNA上的三個(gè)候選m6A修飾位點(diǎn)，隨后通過m6A-RIP和YTHDF1-RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證（圖3G–I）。多核糖體分析進(jìn)一步證實(shí)，沉默YTHDF1降低了RNF7的翻譯效率（圖3J–K）。異種移植腫瘤組織的IHC染色顯示，與對(duì)照相比，YTHDF1敲低組中RNF7水平降低，p27水平升高（圖3L–M）。總之，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了YTHDF1在提高RNF7翻譯效率中的作用，從而促進(jìn)泛素介導(dǎo)的p27蛋白降解，并導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)。

4）RNF7在前列腺癌中起致癌基因的作用

         為了驗(yàn)證YTHDF1/RNF7/p27軸在前列腺癌中的關(guān)鍵作用，我們首先評(píng)估了前列腺癌組織微陣列中RNF7的表達(dá)，并觀察到RNF7和YTHDF1蛋白之間存在正相關(guān)，同時(shí)未檢測(cè)到RNF7 mRNA的顯著變化（圖4A–C）。與RWPE-1相比，RNF7蛋白水平在前列腺癌細(xì)胞系中升高（圖4D）。與YTHDF1的研究結(jié)果一致，高RNF7表達(dá)的患者與較差的預(yù)后相關(guān)（圖4E）。然而，YTHDF1和RNF7聯(lián)合分析的AUC值為0.757，與RNF7單獨(dú)分析的AUC值0.582相比有顯著增加。同時(shí)，與YTHDF1的AUC值0.749相比沒有顯著改善，這進(jìn)一步表明YTHDF1可能參與RNF7蛋白的翻譯過程（圖1E，4F–G）。我們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞中進(jìn)一步進(jìn)行了RNF7敲低，并觀察到腫瘤細(xì)胞增殖顯著抑制（圖4H–L）。如預(yù)期的那樣，我們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞系中過表達(dá)RNF7并結(jié)合YTHDF1敲低，這抵消了YTHDF1敲低對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用（圖4M–P）。

5）YTHDF1敲低可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性

         為了探索YTHDF1在前列腺癌中的臨床應(yīng)用，我們決定研究抑制YTHDF1是否能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。一線化療藥物順鉑（DDP）的抗腫瘤作用的主要分子機(jī)制涉及DNA損傷誘導(dǎo)的ROS依賴性細(xì)胞凋亡。如預(yù)期的那樣，在YTHDF1敲低后進(jìn)行DDP處理顯著降低了腫瘤細(xì)胞的活力（圖5A）。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，敲低YTHDF1顯著增加了細(xì)胞凋亡（圖5B–C），證據(jù)是在DDP處理后增加了cleaved PARP和cleaved caspase3，而過表達(dá)RNF7可以恢復(fù)cleaved PARP和cleaved caspase3的水平（圖5D）。YTHDF1耗盡顯著提高了DDP處理誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，隨后被RNF7過表達(dá)降低（圖5E–G）。一致地，我們?cè)?span>RNF7敲低細(xì)胞中觀察到DDP處理的類似協(xié)同效應(yīng)（圖5H–I）。上述發(fā)現(xiàn)通過體內(nèi)異種移植腫瘤模型得到驗(yàn)證，我們展示了YTHDF1敲低在DDP處理后延緩了腫瘤生長(zhǎng)（圖5J–L）。IHC染色顯示，與對(duì)照相比，YTHDF1敲低組中CC3顯著增加，Ki67顯著減少（圖5M–N）。

6）RNF7可作為前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)

         為了研究抑制RNF7是否具有與YTHDF1類似的臨床應(yīng)用潛力，我們使用了MLN4924，這是一種NAE的小分子抑制劑，通過阻斷cullin neddylation來使RNF7失活。我們發(fā)現(xiàn)MLN4924顯著降低了腫瘤細(xì)胞的活力（圖6A–C）。與之前的結(jié)果一致，將MLN4924添加到腫瘤細(xì)胞中顯著抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，并以泛素化依賴的方式增強(qiáng)了p27蛋白的穩(wěn)定性，且這種效應(yīng)在濃度和時(shí)間梯度上均存在（圖6D–F）。此外，MLN4924與DDP處理聯(lián)合使用顯著增加了細(xì)胞凋亡（圖6G–J）。此外，異種移植腫瘤形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MLN4924給藥抑制了腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性（圖6K–N）?？傊鲜鰯?shù)據(jù)表明MLN4924未來可以進(jìn)一步開發(fā)用于治療前列腺癌患者。

結(jié)論：

         YTHDF1/RNF7/p27軸促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展，為前列腺癌的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         RIP，多聚核糖體分析，qRT-PCR，IHC，異種移植腫瘤模型。

參考文獻(xiàn)：

         Shi Y, Liu B, Zhang Y, Zhao S, Zuo L, Pu J, Zhai H, Mu D, Du J, Cheng Y, Yang C, Chen Y. YTHDF1/RNF7/p27 axis promotes prostate cancer progression. Cell Death Dis. 2025 Apr 18;16(1):314. doi: 10.1038/s41419-025-07648-3.