YTHDF1/RNF7/p27軸促進前列腺癌進展

         前列腺癌（PCa）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是男性最常見的癌癥。在本研究中，我們證明了YTHDF1在PCa癌組織和細胞中高表達，與較差的臨床結果相關。YTHDF1敲除通過蛋白酶體降解信號減少p27蛋白穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤細胞增殖、遷移和異種移植腫瘤形成。一致地，YTHDF1耗盡顯著減少了Pten或/和TP53缺陷類器官的克隆生長。RNF7是YTHDF1的直接下游靶點。RNF7的高翻譯導致細胞周期抑制劑p27的有效降解和惡性腫瘤細胞增長。此外，我們提供了證據表明YTHDF1或RNF7耗盡通過增加細胞凋亡使腫瘤細胞對化療藥物順鉑敏感。我們的研究結果揭示了neddylation抑制劑MLN4924在體外和體內有效抑制前列腺癌進展。我們的研究強調了YTHDF1/RNF7/p27軸是PCa的一個關鍵組成部分，表明其作為新治療靶點的潛力。本文于2025年4月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術路線：

結果：

1）YTHDF1在前列腺癌細胞中高表達

         通過對TCGA數據庫的全面分析，我們觀察到YTHDF1在各種腫瘤類型中高表達，包括前列腺癌（圖1A）。隨后的分析顯示，與對照（鄰近或癌旁）組織相比，前列腺癌組織中YTHDF1的表達顯著升高（圖1B，C）。此外，YTHDF1的升高表達與患者較差的預后顯著正相關（圖1D）。ROC曲線分析顯示，YTHDF1的AUC值為0.749，表明其作為前列腺癌獨立生物標志物的潛力（圖1E）。此外，YTHDF1與前列腺癌的分期相關（圖1F，G）。同時，我們的組織微陣列分析顯示，YTHDF1在前列腺癌組織中顯著過表達（圖1H，I）。我們的研究結果表明，與正常前列腺細胞RWPE-1相比，YTHDF1在前列腺癌細胞系PC3，DU145，22RV-1和LNCaP中顯著過表達（圖1J，K）。我們在DU145和22RV-1中創(chuàng)建了YTHDF1敲低細胞系，證明YTHDF1敲低顯著減少了腫瘤細胞增殖（圖1L–P）。

2）YTHDF1調控腫瘤細胞周期轉變

         鑒于YTHDF1促進前列腺癌細胞增殖，我們發(fā)現通過BrdU摻入實驗（圖2A，B）沉默YTHDF1有效地破壞了細胞周期轉換。流式細胞術分析表明，YTHDF1敲低導致細胞周期在G0/G1期停滯（圖2C）。檢測參與G0/G1期細胞周期轉換的關鍵調控因子，發(fā)現p27蛋白顯著上調，而CDK2、CDK4和CDK6蛋白沒有顯著變化（圖2D）。此外，我們在人正常前列腺RWPE-1細胞中過表達YTHDF1，并評估其潛在的致癌效應，結果表明YTHDF1強制表達增強了細胞增殖（圖2E–I）。在體外證實YTHDF1促進腫瘤細胞增殖后，我們評估了其在體內的效應。最初，我們利用小鼠前列腺癌類器官，研究結果顯示敲低小鼠YTHDF1顯著減少了Pten-或/和TP53缺陷類器官的克隆形成（圖2J–M）。同時，在裸鼠中進行異種移植腫瘤形成的實驗表明，YTHDF1敲低顯著延緩了體內腫瘤生長（圖2N）。異種移植腫瘤表型進一步通過YTHDF1敲低后腫瘤體積的減少得到證實（圖2O），并通過IHC染色確定Ki67染色陽性率顯著降低（圖2P–Q）。

3）YTHDF1提高了RNF7轉錄物的翻譯效率

         為了進一步闡明p27的上調是否是YTHDF1敲低后抑制腫瘤細胞增殖的關鍵因素，我們在YTHDF1敲低的指示細胞中進行了p27的進一步敲低，并發(fā)現p27敲低抵消了YTHDF1的效果（圖3A–B）。值得注意的是，YTHDF1敲低后p27的RNA水平沒有顯著變化?？紤]到YTHDF1不與p27轉錄本結合，我們假設YTHDF1通過其他介質在轉錄后水平減少p27蛋白表達。因此，將放線菌酮（CHX）引入細胞中，結果顯示YTHDF1敲低組中p27蛋白的穩(wěn)定性顯著增強（圖3C）。此外，我們發(fā)現只有蛋白酶體降解信號抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑CQ（氯喹），能夠逆轉YTHDF1過表達和敲低細胞中p27蛋白的減少，這表明YTHDF1通過增強p27蛋白的泛素降解來促進細胞周期進程（圖3D）。因此，我們評估了前列腺癌細胞中p27的泛素化狀態(tài)，并觀察到YTHDF1敲低后其泛素化水平顯著降低（圖3E）。我們分析了已知靶向p27的E3泛素連接酶的表達，如CUL1、SKP1和SKP2。在YTHDF1敲低的腫瘤細胞中，只有RNF7，是E3泛素連接酶RBX/ROC RING的一個關鍵亞單位，對癌細胞生長至關重要，與對照細胞相比顯著減少。同時，CUL1、SKP1和SKP2的水平保持不變（圖3F），而RNF7的mRNA幾乎沒有變化。重要的是，我們使用m6A Atlas數據集預測了RNF7 mRNA上的三個候選m6A修飾位點，隨后通過m6A-RIP和YTHDF1-RIP實驗進行了驗證（圖3G–I）。多核糖體分析進一步證實，沉默YTHDF1降低了RNF7的翻譯效率（圖3J–K）。異種移植腫瘤組織的IHC染色顯示，與對照相比，YTHDF1敲低組中RNF7水平降低，p27水平升高（圖3L–M）?？傊@些發(fā)現證實了YTHDF1在提高RNF7翻譯效率中的作用，從而促進泛素介導的p27蛋白降解，并導致腫瘤的生長。

4）RNF7在前列腺癌中起致癌基因的作用

         為了驗證YTHDF1/RNF7/p27軸在前列腺癌中的關鍵作用，我們首先評估了前列腺癌組織微陣列中RNF7的表達，并觀察到RNF7和YTHDF1蛋白之間存在正相關，同時未檢測到RNF7 mRNA的顯著變化（圖4A–C）。與RWPE-1相比，RNF7蛋白水平在前列腺癌細胞系中升高（圖4D）。與YTHDF1的研究結果一致，高RNF7表達的患者與較差的預后相關（圖4E）。然而，YTHDF1和RNF7聯合分析的AUC值為0.757，與RNF7單獨分析的AUC值0.582相比有顯著增加。同時，與YTHDF1的AUC值0.749相比沒有顯著改善，這進一步表明YTHDF1可能參與RNF7蛋白的翻譯過程（圖1E，4F–G）。我們在前列腺癌細胞中進一步進行了RNF7敲低，并觀察到腫瘤細胞增殖顯著抑制（圖4H–L）。如預期的那樣，我們在前列腺癌細胞系中過表達RNF7并結合YTHDF1敲低，這抵消了YTHDF1敲低對腫瘤細胞增殖的抑制作用（圖4M–P）。

5）YTHDF1敲低可促進腫瘤細胞對化療的敏感性

         為了探索YTHDF1在前列腺癌中的臨床應用，我們決定研究抑制YTHDF1是否能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。一線化療藥物順鉑（DDP）的抗腫瘤作用的主要分子機制涉及DNA損傷誘導的ROS依賴性細胞凋亡。如預期的那樣，在YTHDF1敲低后進行DDP處理顯著降低了腫瘤細胞的活力（圖5A）。流式細胞術分析證實，敲低YTHDF1顯著增加了細胞凋亡（圖5B–C），證據是在DDP處理后增加了cleaved PARP和cleaved caspase3，而過表達RNF7可以恢復cleaved PARP和cleaved caspase3的水平（圖5D）。YTHDF1耗盡顯著提高了DDP處理誘導的細胞內ROS水平，隨后被RNF7過表達降低（圖5E–G）。一致地，我們在RNF7敲低細胞中觀察到DDP處理的類似協同效應（圖5H–I）。上述發(fā)現通過體內異種移植腫瘤模型得到驗證，我們展示了YTHDF1敲低在DDP處理后延緩了腫瘤生長（圖5J–L）。IHC染色顯示，與對照相比，YTHDF1敲低組中CC3顯著增加，Ki67顯著減少（圖5M–N）。

6）RNF7可作為前列腺癌的潛在治療靶點

         為了研究抑制RNF7是否具有與YTHDF1類似的臨床應用潛力，我們使用了MLN4924，這是一種NAE的小分子抑制劑，通過阻斷cullin neddylation來使RNF7失活。我們發(fā)現MLN4924顯著降低了腫瘤細胞的活力（圖6A–C）。與之前的結果一致，將MLN4924添加到腫瘤細胞中顯著抑制了腫瘤細胞增殖，并以泛素化依賴的方式增強了p27蛋白的穩(wěn)定性，且這種效應在濃度和時間梯度上均存在（圖6D–F）。此外，MLN4924與DDP處理聯合使用顯著增加了細胞凋亡（圖6G–J）。此外，異種移植腫瘤形成實驗驗證了MLN4924給藥抑制了腫瘤生長并增強了腫瘤細胞對DDP的敏感性（圖6K–N）?？傊鲜鰯祿砻?span>MLN4924未來可以進一步開發(fā)用于治療前列腺癌患者。

結論：

         YTHDF1/RNF7/p27軸促進前列腺癌進展，為前列腺癌的治療提供了新的治療靶點。

實驗方法：

         RIP，多聚核糖體分析，qRT-PCR，IHC，異種移植腫瘤模型。

參考文獻：

         Shi Y, Liu B, Zhang Y, Zhao S, Zuo L, Pu J, Zhai H, Mu D, Du J, Cheng Y, Yang C, Chen Y. YTHDF1/RNF7/p27 axis promotes prostate cancer progression. Cell Death Dis. 2025 Apr 18;16(1):314. doi: 10.1038/s41419-025-07648-3.