靶向RTN4的內質網(wǎng)膜重塑誘導焦亡以促進抗腫瘤免疫

         焦亡是一種已確定的程序性細胞死亡，與內質網(wǎng)（ER）動力學高度相關。然而，目前尚不清楚調節(jié)觸發(fā)焦亡的動態(tài)ER膜曲率變化的關鍵蛋白質。本研究合成了一種生物素標記的強效焦亡誘導劑α-山竹素（α-MG）化學探針。通過蛋白質微陣列分析，網(wǎng)織蛋白-4（RTN4/Nogo）作為ER膜曲率的關鍵調節(jié)因子，被確定為α-MG的靶點。作者觀察到，α-MG通過募集E3連接酶UBR5化學誘導RTN4的蛋白酶體降解顯著增強了癌癥細胞的焦下垂表型。有趣的是，RTN4表達的下調顯著促進了ER膜曲率的動態(tài)重塑，從小管過渡到片狀，從而導致ER與細胞質膜的快速融合。特別是，觀察到幾個關鍵的ER標記物向焦亡細胞的“氣泡”結構的易位支持了ER與質膜的融合過程。此外，α-MG誘導的RTN4敲除導致丙酮酸激酶M2（PKM2）依賴的常規(guī)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/胃泌素E（GSDME）裂解，從而導致焦亡進展。在體內，作者觀察到化學或基因RTN4敲低顯著抑制癌癥細胞生長，這進一步表現(xiàn)出抗程序性死亡-1（抗PD-1）的抗腫瘤免疫反應。在轉化研究中，RTN4的高表達與腫瘤轉移和患者死亡密切相關。綜上所述，RTN4通過調節(jié)ER膜曲率重塑在誘導焦亡中起著重要作用，因此是抗癌免疫治療的一個有前景的藥物靶點。該研究于2025年2月發(fā)表在《Protein & Cell》，IF 13.6分。

技術路線：

主要研究結果：

1 RTN4作為焦亡功能蛋白的發(fā)現(xiàn)

         化學遺傳學是利用生物活性小分子作為化學工具發(fā)現(xiàn)功能蛋白的關鍵策略。通過基于焦亡表型的高內涵篩選，作者首次發(fā)現(xiàn)α-莽果素（α-MG），一種天然衍生的黃酮衍生物，是一種有效的化學探針，能夠誘導顯著的焦亡表型（圖 1A 和 S1A）。在這里，作者選擇了表現(xiàn)出最顯著表型變化的骨肉瘤細胞進行進一步研究。作者觀察到，α-MG 以濃度和時間依賴性的方式通過 Annexin V-PI 雙染色（圖 1B）、流式定量分析（圖 1C）和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗（圖 1D）增加了 U2OS 細胞中焦亡的比例。免疫印跡分析還證實，α-MG 誘導了典型的 caspase-3 裂解 GSDME（圖 1E），表明這是一種有效的化學工具，可用于研究焦亡生物學。具體來說，為了研究 GSDME 介導的焦亡是否是 α-MG 誘導的細胞死亡的主要機制，作者利用小干擾 RNA（siRNA）進行敲低實驗，有效抑制 GSDME 的表達。如圖 1F-H 所示，沉默 GSDME 導致 α-MG 誘導的焦亡體形成和 LDH 釋放顯著逆轉，表明焦亡依賴于 GSDME。此外，作者還檢測了不同骨肉瘤細胞（U2OS、HOS 和 143B）和正常成骨細胞系 MC3T3 以及臨床骨肉瘤樣本中 GSDME 的表達水平。如圖 S1B 所示，這些骨肉瘤細胞中的 GSDME 表達顯著高于對照組 MC3T3 細胞，表明骨肉瘤可能包含一個表現(xiàn)出較高 GSDME 表達水平的細胞亞群。同時，在臨床骨肉瘤樣本中也觀察到了 GSDME 水平的存在，證實了細胞培養(yǎng)研究的結果（圖 S1B）。此外，作者還通過免疫組化檢測了來自 102 例原發(fā)性骨肉瘤患者的石蠟包埋標本中的 GSDME 表達。結果顯示，與腫瘤旁組織相比，骨肉瘤中 GSDME 的表達較高。特別是，骨肉瘤組織中 GSDME 的高表達與患者 3 年內腫瘤轉移和死亡呈正相關（圖 S1C-E）。與此同時，骨肉瘤組織中 caspase-3 的水平在與腫瘤轉移和患者 3 年內死亡率相關方面并未表現(xiàn)出顯著差異（圖 S1D 和 S1F）。

         鑒于 caspase-3 和 GSDME 是細胞焦亡中的兩個關鍵因素，作者提出 caspase-3 可能是促進骨肉瘤細胞焦亡的 GSDME 的潛在協(xié)同因子。因此，GSDME 可以作為研究骨肉瘤發(fā)病風險的評估因素，而 caspase-3 可以與之結合用于評估?？傮w而言，這些結果表明 α-MG 傾向于誘導高表達 GSDME 的骨肉瘤細胞發(fā)生焦亡。由于 α-MG 之前已被證實可以抑制 IDH1-R132H，作者建立了過表達 IDH1-R132H 的 U2OS 細胞，并隨后通過 Annexin V-PI 雙染色評估 α-MG 對細胞焦亡的影響。作者觀察到，與野生型對照 U2OS 細胞相比，過表達 IDH1-R132H 的 U2OS 細胞并沒有導致 α-MG 誘導的焦亡表型發(fā)生顯著變化（圖 S1G 和 S1H）。此外，作者還利用經(jīng)典的 IDH1-R132H 抑制劑 AGI-5198 處理 U2OS 細胞，并在 α-MG 存在的情況下進行實驗。作者的結果顯示，AGI-5198 并沒有顯著影響 α-MG 在 U2OS 細胞中誘導的焦亡表型，如通過 Annexin V-PI 雙染色評估的那樣（圖 S1I 和 S1J）。因此，作者提出 IDH1-R132H 可能不是 α-MG 誘導的 U2OS 細胞焦亡的主要貢獻者。為了探索 α-MG 的生物學靶點，作者合成了生物素標記的 α-MG（生物素 - α-MG，圖 S2A-F），以發(fā)現(xiàn)潛在的結合蛋白，使用 HuProt 蛋白組微陣列，隨后與 Cy3-標記的鏈霉親和素孵育（圖 1I）。結果表明，被鑒定為與 α-MG 結合的蛋白質中，信號與噪聲比（SNR）最高的蛋白質是網(wǎng)膜蛋白 - 4（RTN4）（圖 1J）。眾所周知，RTN4 包含三種主要亞型：RTN4A、RTN4B 和 RTN4C，它們是內質網(wǎng)曲率的關鍵調節(jié)因子。在這里，作者發(fā)現(xiàn)通過癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫分析，RTN4B 是在各種腫瘤中表達的主要 RTN4 亞型，特別是在肉瘤中（圖 S1K）。

         接下來，作者發(fā)現(xiàn)生物素 - α-MG 主要捕獲了 RTN4B 和少量的 RTN4C，通過競爭性拉下實驗（圖 1K）。因此，作者專注于 RTN4B 進行進一步研究。微量熱泳（MST）實驗表明，α-MG 和生物素 - α-MG 都能直接與 RTN4 結合（α-MG KD = 12.1 ± 1.28 nmol/L，生物素 - α-MG KD = 39.0 ± 1.09 nmol/L）（圖 1L 和 S2G）。此外，分子對接分析揭示了 α-MG 通過與殘基如谷氨酸（GLU）34、GLU 37 和丙氨酸 341 形成多個氫鍵，在 RTN4 周圍形成空間鍵合（圖 1M）。同樣，生物素 - α-MG 也通過與 GLU 34、GLU 37 和 GLU 41 建立幾個氫鍵與 RTN4 結合（圖 S2H）?？傊髡叽_定 RTN4 是 α-MG 的直接結合蛋白，與焦亡進展高度相關。

圖1：發(fā)現(xiàn) RTN4 作為焦亡中的功能性蛋白

2 RTN4缺乏顯著促進焦亡表型

         為了確定 RTN4 是否在焦亡進展中發(fā)揮作用，作者在骨肉瘤細胞系（U2OS、HOS 和 143B）中進行了 RTN4 沉默實驗，并通過 Annexin V-PI 雙染色觀察到顯著的焦亡相關“氣泡”形態(tài)（圖 2A 和 S3A）。其他細胞系如 HeLa 和 MGC803 也觀察到了類似的表型（圖 2A）。此外，流式細胞儀分析顯示，RTN4 siRNA 顯著提高了 Annexin V-PI 陽性焦亡細胞的比例（圖 2B 和 S3B）。接下來，作者構建了一個基于 lentiviral miR30 的 Tet 誘導型（pLKO-Tet-On）短發(fā)夾 RNA（shRNA）系統(tǒng)，以特異性地在 U2OS 細胞中敲低 RTN4（圖 S3C 和 S3D）。如圖 2C 所示，多西環(huán)素（dox）顯著誘導了 U2OS 細胞中的典型焦亡“氣泡”形態(tài)，通過 Annexin V-PI 雙染色（圖 2D）。此外，dox 處理增加了 U2OS 細胞中的 LDH 釋放（圖 2E），表明 RTN4 缺失對焦亡進展有重要貢獻。接下來，作者探索了 RTN4 敲低與各種細胞應激刺激的協(xié)同效應。作者觀察到，RTN4 敲低增強了 TNF-α/環(huán)己酰亞胺（CHX）（Hu 等，2020）或順鉑（DDP）（Wang 等，2017）處理的 U2OS 細胞中的焦亡表型（圖 2F）。與此同時，HeLa 和 MGC803 細胞在 RTN4 敲低后對焦亡的敏感性增加（圖 S3E）。這些觀察結果通過定量流式細胞儀測量（圖 2G）和 LDH 釋放實驗（圖 2H）得到了進一步證實。隨后，缺氧（Yu 等，2019）和紫外線輻射（Liu 等，2021）等物理刺激也顯示出在 RTN4 敲低存在的情況下對焦亡誘導的協(xié)同效應（圖 2I-K 和 S3F）。有趣的是，化學和物理應激均下調了 RTN4 的表達，這代表了焦亡過程中的一種普遍生物學反應（圖 2L）。此外，免疫印跡實驗表明，RTN4 缺失顯著激活了 caspase-3 以裂解 GSDME（圖 2M 和 S3G），并隨后在 RAW264.7 巨噬細胞中引發(fā)強烈的免疫反應，通過增強 TNFα、IL-6、iNOS 和 IL-1β 等炎癥基因的表達（圖 2N 和 S3H）。最后，作者在 TetOn-RTN4 shRNA U2OS 穩(wěn)定細胞系中進行了拯救實驗，以闡明介導焦亡的 RTN4 亞型。值得注意的是，作者的結果表明，在圖 S3I 中，過表達 RTN4B 有效地恢復了 caspase-3 和 GSDME 的裂解，而轉染 RTN4A 或 RTN4C 質粒則沒有產(chǎn)生類似的效果?？傊@些發(fā)現(xiàn)強烈表明 RTN4B 在調節(jié)焦亡中起著關鍵作用。

圖2：RTN4 缺陷顯著促進細胞焦亡表型

3 α-MG通過在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中募集E3連接酶UBR5作為RTN4降解劑

         接下來，作者研究了 α-MG 對 RTN4 表達的影響。有趣的是，作者觀察到 α-MG 以濃度和時間依賴性的方式顯著降低了 RTN4 蛋白的表達（圖 3A 和 S4A），但并未影響 mRNA 水平（圖 S4B）。然后，作者使用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）阻斷 RTN4 蛋白合成，并發(fā)現(xiàn) α-MG 處理后 RTN4 表達仍然被下調，這表明 α-MG 作為一種 RTN4 化學降解劑（圖 3B）。隨后的 MG132 和巴非霉素 A1（BafA1）處理表明，α-MG 主要通過蛋白酶體途徑而非溶酶體途徑降解 RTN4（圖 3C）。鑒于 RTN4 的降解主要依賴于蛋白酶體途徑，作者接下來研究了 RTN4 是否經(jīng)歷了泛素化修飾。西方印跡分析顯示，α-MG 顯著促進了 RTN4 的泛素化修飾（圖 3D）。特別是，這種泛素化修飾主要通過 K48 依賴的泛素鏈形成介導，對 K63 泛素鏈形成的影響較?。▓D 3E）。作者隨后假設 α-MG 通過招募特定的 E3 泛素連接酶來促進 RTN4 的 K48 依賴性泛素化修飾。因此，作者在 MG132 處理后對 HA 標簽的 RTN4 進行免疫沉淀，并通過質譜（MS）鑒定相互作用蛋白（圖 3F）。然后，作者鑒定了 1290 種與 RTN4 相互作用的細胞內蛋白。在篩選 RTN4 的關鍵泛素連接酶后，作者最終鑒定了 6 種 E3 泛素連接酶，包括 TRIM21、UBR5、TRIM28、TRAF7、CHIP 和 TRIP12（圖 3F）。與此同時，作者還鑒定了 E1 泛素激活酶 UBA1 和 E2 泛素酶 UBE2D3（圖 3F）。為了進一步確定哪種 E3 泛素連接酶參與 RTN4 的泛素化，作者使用 siRNA 敲低這些 E3 泛素連接酶的表達。然后，作者用 α-MG 處理細胞，發(fā)現(xiàn)只有在 UBR5 敲低時，α-MG 誘導的 RTN4 降解才被逆轉（圖 3G）。此外，UBR5 敲低有效地阻礙了 α-MG 誘導的焦亡體形成（圖 S4C）。此外，作者觀察到 UBR5 過表達在 U2OS 細胞中誘導了“氣泡”形態(tài)，通過 Annexin V-PI 雙染色評估并經(jīng)流式細胞儀分析定量（圖 3H 和 3I）。因此，作者得出結論，α-MG 可能促進了 UBR5 和 RTN4 之間的類似分子膠的相互作用，隨后通過 K48 依賴途徑增強了下游蛋白酶體對 RTN4 的降解。

圖3：α-MG 通過在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中募集 E3 連接酶 UBR5 作為 RTN4 降解劑

4 RTN4敲除通過管狀到片狀變化重塑ER膜曲率

         由于 RTN4 是調節(jié)內質網(wǎng)膜曲率的關鍵蛋白，因此 RTN4 缺失可能會對內質網(wǎng)的形態(tài)特征產(chǎn)生影響。在這里，共聚焦熒光分析顯示，通過 siRNA 敲低 RTN4 誘導 U2OS 細胞中內質網(wǎng)形態(tài)從網(wǎng)格狀管狀結構轉變?yōu)楸馄狡瑺罱Y構，這些細胞轉染了內質網(wǎng)標記物 Sec61β-EGFP 和 Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）-pDsRed2（圖 4A）。此外，作者觀察到化學誘導的 RTN4 降解通過 α-MG 也顯著觸發(fā)了內質網(wǎng)管狀到片狀的轉變（圖 4B）。此外，作者通過透射電子顯微鏡（TEM）分析證實，在 RTN4 siRNA 和 α-MG 處理的 U2OS 細胞中，長度超過 10μm 的片狀內質網(wǎng)比例顯著增加（圖 4C 和 4D）。由于 atlastin-1 是管狀內質網(wǎng)形成的關鍵介質，作者還進行了定量實時 PCR（qPCR）分析，發(fā)現(xiàn) RTN4 沉默的 U2OS 細胞以及 HeLa 和 MGC803 中 atlastin-1 的 mRNA 表達顯著下調（圖 4E），表明內質網(wǎng)管狀到片狀的轉變與細胞內 RTN4 的表達高度相關。最近的證據(jù)表明，RTN4 形態(tài)失衡可能會誘導內質網(wǎng)應激（Kuang 等，2006；Oertle 等，2003）。然后，作者通過 Annexin V-PI 雙染色觀察到，內質網(wǎng)應激抑制劑牛磺膽酸（TUDCA）或 4-苯基丁酸（4-PBA）逆轉了 RTN4 敲低誘導的類似“氣泡”的焦亡表型（圖 4F）。與此同時，內質網(wǎng)應激誘導劑硫代巴比妥酸（TG）或鵝去氧膽酸（TM）顯著增強了 U2OS 細胞中的“氣泡”形態(tài)（圖 4F）。這些發(fā)現(xiàn)也通過流式細胞儀（圖 4G）和 LDH 釋放實驗（圖 4H）得到了證實，表明內質網(wǎng)應激在 RTN4 缺失誘導的焦亡中具有關鍵的橋梁功能。

         接下來，為了深入了解 RTN4 與內質網(wǎng)形態(tài)轉變之間的關系，作者進行了共免疫沉淀（co-IP）實驗，以捕獲細胞中的 RTN4 結合蛋白。然后，96 種蛋白顯著富集，并被分為五類，包括細胞骨架動態(tài)、膜流動性、轉錄因子、內質網(wǎng)應激和其他（圖 4I）。在這些 RTN4 結合蛋白中，丙酮酸激酶 M2（PKM2）特別引起了作者的興趣。由于 PKM2 之前已被報道與通過調節(jié)內質網(wǎng)應激調節(jié)焦亡進程高度相關，并且因此被認為是進一步研究的關鍵候選蛋白。為了測試 RTN4 與 PKM2 的相互作用，作者進行了 co-IP 實驗，并發(fā)現(xiàn) RTN4 直接與 PKM2 結合（圖 4J）。與此同時，α-MG 的處理導致 PKM2 表達下調，最終導致 GSDME 的裂解（圖 4K）。此外，通過微量熱泳（MST）分析定量表征 RTN4 與 PKM2 之間的親和力，解離常數(shù)（KD）為 151.12 ± 16.84 nmol/L（圖 4L），表明 RTN4 與 PKM2 之間存在強烈的相互作用。此外，PKM2 敲低在 U2OS 細胞中引發(fā)了“氣泡”形態(tài)，通過 Annexin V-PI 雙染色（圖 4M 和 4N）。與此同時，PKM2 敲低促進了 LDH 釋放，最終通過誘導 caspase-3/GSDME 激活觸發(fā)焦亡（圖 4O-Q）。接下來，為了研究 PKM2 對內質網(wǎng)膜曲率的影響，作者在表達內質網(wǎng)標記 Sec61βEGFP 的 U2OS 細胞中進行了共聚焦熒光分析。PKM2 敲低未能誘導內質網(wǎng)管狀到片狀的轉變（圖 S5A）。此外，作者觀察到 UBR5 過表達誘導內質網(wǎng)形態(tài)從網(wǎng)格狀管狀結構轉變?yōu)楸馄狡瑺罱Y構（圖 S5B）。與此同時，通過 siRNA 敲低 UBR5 對內質網(wǎng)膜曲率的改變沒有明顯影響（圖 S5C）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明 UBR5 而不是 PKM2 是調節(jié)內質網(wǎng)膜曲率重塑的上游信號通路。最后，作者進行了實驗，深入探討內質網(wǎng)膜曲率重塑與 caspase-3/GSDME 信號之間的相關性。作者的結果表明，通過使用 Z-DEVDFMK 抑制 caspase-3 或通過 siRNA 耗盡 GSDME，并沒有對內質網(wǎng)膜曲率產(chǎn)生任何顯著影響，例如“管狀到片狀”的轉變（圖 S5D 和 S5E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，caspase-3/GSDME 信號可能位于內質網(wǎng)膜曲率重塑的下游。總之，作者的發(fā)現(xiàn)表明，RTN4 缺失誘導的內質網(wǎng)膜曲率變化通過內質網(wǎng)應激信號通路導致焦亡。

圖4：RTN4 敲低通過腎小管到片層的變化重塑 ER 膜曲率

5 在焦亡過程中，膜曲率的變化驅動內質網(wǎng)融合到“氣泡”結構

       “氣泡”結構的形成是焦亡中的一個重要生物學事件（Chen 等，2016）。為了探索內質網(wǎng)在 RTN4 缺失誘導的類似“氣泡”的表型中的作用，作者應用了一系列細胞器熒光探針（內質網(wǎng)追蹤劑、線粒體追蹤劑、溶酶體追蹤劑、高爾基體追蹤劑和細胞膜追蹤劑 DiI）。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn) RTN4 敲低誘導的“氣泡”結構明顯被內質網(wǎng)追蹤劑標記，但未被線粒體追蹤劑或溶酶體追蹤劑標記；而這些“氣泡”結構被高爾基體追蹤劑和 DiI 輕微標記（圖 5A）。相應地，作者還通過透射電子顯微鏡（TEM）成像證實了 α-MG 處理后“氣泡”結構中內質網(wǎng)的存在（圖 5B）。接下來，為了確認內質網(wǎng)與“氣泡”結構之間的直接聯(lián)系，作者在 U2OS 細胞中過表達內質網(wǎng)標記物（Sec61β、Calnexin、KDEL）。活細胞成像分析顯示，通過 siRNA 敲低 RTN4 后，Sec61β-EGFP 的綠色熒光出現(xiàn)在“氣泡”結構中（圖 5C）。類似的結果也在多西環(huán)素誘導的 RTN4 敲低模型中得到證實（圖 5D）。此外，Calnexin-EGFP 標記的內質網(wǎng)膜和 pDsRed2-KDEL 標記的內質網(wǎng)腔在 RTN4 敲低細胞的“氣泡”結構中也高度表達（圖 5E 和 5F）。RTN4 降解劑 α-MG 在熒光共聚焦中模擬了遺傳性 RTN4 敲低，將這些內質網(wǎng)標記物轉移到“氣泡”結構中（圖 S6B 和 S6C）。此外，RTN4 沉默顯著促進了 Sec61β-EGFP 標記的內質網(wǎng)膜與 GSDME-N 孔在“氣泡”結構周圍的共定位（圖 S6D）。與此同時，RTN4 降解劑 α-MG 展示了誘導 Sec61β 標記的內質網(wǎng)膜轉移的類似效果（圖 S6E）。此外，免疫印跡實驗表明，內質網(wǎng)蛋白（Sec61β、Calnexin 和 KDEL）在響應 RTN4 敲低時從細胞質釋放到培養(yǎng)上清液中（圖 5G），進一步支持了作者的假設，即內質網(wǎng)可能在焦亡過程中通過促進其膜與“氣泡”結構融合來發(fā)揮作用。值得注意的是，脂質體結合實驗表明，純化的片狀內質網(wǎng)蛋白而非管狀內質網(wǎng)蛋白對類似細胞內膜的脂質體具有結合偏好（圖 5H、5I 和 S6F）。此外，內質網(wǎng)膜蛋白，包括 Sec61β 和 Calnexin，主要存在于由片狀內質網(wǎng)成分構成的脂質體結合沉淀物中（圖 5J）。總之，這些數(shù)據(jù)表明內質網(wǎng)在焦亡進程中高度參與，通過促進其膜與“氣泡”結構融合來發(fā)揮作用。

圖5：RTN4 敲低促進 ER 膜融合到“氣泡”結構

6質膜紊亂協(xié)同促進RTN4缺乏誘導的焦亡

         由于內質網(wǎng)膜可能通過內質網(wǎng) - 細胞膜融合參與構建“氣泡”結構，作者推測細胞膜穩(wěn)態(tài)可能影響焦亡進程。為此，作者使用兩性表面活性劑 Triton X-100 輕度處理細胞，部分去除 Triton X-100 可溶解的細胞膜成分（Adachi 等，2007）。如圖 6A 所示，Triton X-100 單獨使用并未在 U2OS 細胞中引發(fā)明顯的焦亡；然而，Triton X-100 顯著增加了多西環(huán)素誘導的“氣泡”結構比例，通過 Annexin V-PI 雙染色和流式分析（圖 6B）。此外，Triton X-100 也顯著促進了多西環(huán)素誘導的 U2OS 細胞中的 LDH 釋放（圖 6C）。同樣，Triton X-100 加速了 RTN4 降解劑 α-MG 誘導的 U2OS 細胞中的“氣泡”結構形成（圖 6D-F）。此外，GSDME-N 過表達增強了 α-MG 誘導的焦亡中的“氣泡”結構形成（圖 6G 和 6H）?？傊@些結果表明細胞膜穩(wěn)態(tài)在促進 RTN4 敲低誘導的焦亡中的“氣泡”結構形成中發(fā)揮著重要作用。

圖6：質膜干擾協(xié)同促進 RTN4 缺陷誘導的焦亡

7 RTN4降解劑在抗癌治療中的轉化研究

         為了評估針對 RTN4 的抗癌潛力，作者建立了 3D 腫瘤球體模型，并用 Calcein-AM 和 EthD-1 進行染色（Kamoshima 等，2011）。如圖 7A 所示，多西環(huán)素在抑制 3D 腫瘤模型生長方面表現(xiàn)出濃度依賴性抗腫瘤活性。RTN4 降解劑 α-MG 也顯示出類似的結果（圖 7A）。接下來，作者利用表達 RTN4 shRNA 的 K7M2 細胞建立了骨肉瘤異種移植小鼠模型，該模型由多西環(huán)素激活。作者發(fā)現(xiàn)，通過腫瘤內注射多西環(huán)素，可以通過下調 RTN4 表達有效抑制腫瘤形成（圖 7B、7C、S7A 和 S7B）。接下來，為了探索 RTN4 降解用于抗癌治療的臨床轉化可行性，作者測試了 RTN4 降解劑 α-MG 對攜帶 K7M2 腫瘤的小鼠的口服給藥的治療效果。作者觀察到，α-MG（50 或 100 mg/kg）顯著減少了 K7M2 腫瘤的大小（圖 S7C 和 S7D）和重量（圖 S7E），而沒有體重減輕（圖 S7F）。此外，免疫組化（IHC）分析顯示，α-MG 在腫瘤組織中顯著上調了 T 細胞標記物 CD8、NK 細胞標記物 CD56 以及巨噬細胞標記物 F4/80 的水平（圖 S7G），表明激活了明顯的抗腫瘤免疫反應。

         與此同時，作者發(fā)現(xiàn)程序性細胞死亡 1 配體 1（PD-L1）的表達在 α-MG 處理后顯著上調（圖 S7G），暗示了 α-MG 與免疫檢查點療法的協(xié)同可能性。然后，作者設計了一個聯(lián)合方案，將 α-MG 與抗 PD-1 抗體聯(lián)合使用（圖 7D）。作者的結果顯示，α-MG 給藥與抗 PD-1 治療聯(lián)合使用在減少腫瘤體積和重量方面顯示出顯著的協(xié)同作用（圖 7E、7F 和 S7H），而沒有對體重、器官重量和血清生化指標產(chǎn)生明顯的不良影響（圖 S7I-L）。此外，作者通過免疫組化方法檢測了來自 101 例原發(fā)性骨肉瘤患者的石蠟包埋標本中的 RTN4 表達（圖 7G、7H 和 S8）。此外，作者評估了骨肉瘤組織和正常骨組織的免疫組化特征，結果顯示骨肉瘤組織中 RTN4 的表達相對較高（圖 S7M）。因此，這些結果表明 RTN4 可能是抗癌轉化醫(yī)學研究中的一個可用生物標志物或治療靶點。鑒于 RTN4 在焦亡以及骨肉瘤進展中的功能重要性，抑制 RTN4 代表了一種潛在的抗癌策略。為此，作者利用包含 10845 種化合物的 DrugBank 數(shù)據(jù)庫進行了高通量虛擬篩選。每個化合物都被對接到由 I-TASSER 生成的 RTN4 結構的預測結合口袋中。隨后，計算了 Glide XP GScore 值（kcal/mol），這些值代表了這些化合物與 RTN4 結合的親和力。從這次篩選中，作者選擇了排名前 20 的化合物（圖 7I）進行進一步的實驗驗證。通過 MST 實驗，作者證實了這些化合物中的大多數(shù)對 RTN4 具有很強的結合親和力（圖 S7N）。此外，通過在 U2OS 細胞中進行焦亡特征分析（明場顯微鏡和 Annexin V-PI 雙染色）表明，米托蒽醌、克唑替尼和伊達比星顯著誘導了焦亡（圖 S7O、S7P 和 7J）?？傊?，作者證明了靶向 RTN4 誘導焦亡的潛力，為開發(fā)針對 RTN4 的治療藥物提供了先導化合物。

圖7：RTN4 降解劑用于抗癌治療的轉化研究

結論：

         總之，作者表明 RTN4 通過動態(tài)重塑 ER 膜曲率高度參與驅動焦亡。這些發(fā)現(xiàn)可能為作者理解焦亡過程中的基本 ER 生物學提供一個有吸引力的方向，并強調 RTN4 作為有價值的抗癌靶點的重要性。

實驗方法：

         免疫熒光，RT-qPCR，Western blot，免疫組化

參考文獻：

         Zhao MM, Ren TT, Wang JK, Yao L, Liu TT, Zhang JC, Liu Y, Yuan L, Liu D, Xu JH, Tu PF, Tang XD, Zeng KW. Endoplasmic reticulum membrane remodeling by targeting reticulon-4 induces pyroptosis to facilitate antitumor immune. Protein Cell. 2025 Feb 1;16(2):121-135. doi: 10.1093/procel/pwae049. PMID: 39252612; PMCID: PMC11786723.