肥大細胞受體通過腦膜-腦軸介導卒中后腦部炎癥

   大腦周圍的免疫環(huán)境在監(jiān)測損傷信號方面起著基礎性作用。包括缺血性卒中在內(nèi)的損傷，會破壞這種平衡并引發(fā)過度的炎癥反應，但其潛在機制尚不清楚。研究人員首次證明，肥大細胞特異性受體Mrgprb2從腦膜層面對卒中后腦部炎癥進行調(diào)控。卒中后，Mrgprb2會引起腦膜肥大細胞脫顆粒，釋放免疫介質(zhì)。這一過程首先將顱骨骨髓中的中性粒細胞募集至硬腦膜，隨后通過切割化學排斥因子信號素3a (sema3a)，進一步促進中性粒細胞從硬腦膜遷移至大腦內(nèi)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，其人類同源受體MRGPRX2在人腦膜肥大細胞中表達，并在卒中后因神經(jīng)肽P物質(zhì)的上調(diào)而被激活。藥理學抑制Mrgprb2可減輕小鼠卒中后炎癥并改善神經(jīng)功能預后，這為治療提供了一個潛在的藥物靶點?？偠灾?，研究結(jié)果確定Mrgprb2是免疫細胞從顱骨骨髓儲存庫遷移至大腦的關鍵“腦膜守門員”。本文于2025年7月發(fā)布于《Cell》,IF 42.5。

圖形摘要

技術路線

主要研究結(jié)果

1.Mrgprb2促進缺血性卒中后損傷

   研究人員首先探究肥大細胞是否通過Mrgprb2參與缺血性卒中的病理過程。為模擬缺血性卒中，研究人員在野生型（WT）小鼠和Mrgprb2基因敲除型（Mrgprb2?/?）小鼠中實施了短暫性大腦中動脈閉塞（tMCAO）手術（圖1A）。通過激光多普勒監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在tMCAO手術期間，WT小鼠和Mrgprb2?/?小鼠的腦血流降低程度無差異，這表明卒中誘導效果相當。閉塞40分鐘后撤除栓塞線，小鼠恢復48小時，隨后測量梗死腦組織體積。使用化學染色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)（該染色劑能使活組織呈紅色而梗死組織不著色）進行染色，研究人員發(fā)現(xiàn)Mrgprb2?/?小鼠的腦梗死體積顯著減?。▓D1B和1C）。MRI（磁共振成像）進一步證實了這一結(jié)果：在48小時時，與WT小鼠相比，Mrgprb2?/?小鼠的梗死體積減少了22%±5%（圖1D和1E）。Mrgprb2?/?小鼠的中線移位程度也減輕，表明腦水腫和腦實質(zhì)損傷減輕。

圖1 Mrgprb2基因敲除小鼠免受缺血性卒中損傷

   為了明確這些可量化的梗死體積差異是否轉(zhuǎn)化為局灶性神經(jīng)功能缺損的差異，研究人員開展了多項行為學測試。使用28分神經(jīng)評分量表，研究人員發(fā)現(xiàn)，與Mrgprb2?/?小鼠相比，野生型（WT）小鼠早在tMCAO術后24小時就表現(xiàn)出更嚴重的運動感覺功能缺損（圖1F）。在轉(zhuǎn)棒實驗中，WT小鼠的表現(xiàn)也差于Mrgprb2?/?小鼠，顯示出嚴重的運動功能障礙（圖1G）。與右側(cè)顳葉半球梗死相一致，通過CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，WT小鼠的左前爪和左后爪趾間距（第一趾與第四趾之間的距離）減?。▓D1H），而右爪則未觀察到這種現(xiàn)象。除了神經(jīng)功能缺損較輕外，Mrgprb2?/?小鼠在tMCAO術后30天的存活率也更高（圖1I）。

2. 表達Mrgprb2的腦膜肥大細胞在卒中后被激活

   接下來，研究人員旨在明確在缺血性卒中背景下，這些表達Mrgprb2的肥大細胞的位置。為了闡明表達Mrgprb2的肥大細胞是否存在于腦膜或腦實質(zhì)中，研究人員利用了Mrgprb2-Cre；Rosa26-tdTomato(tdT)報告基因小鼠（該品系小鼠僅在表達Mrgprb2的細胞中表達tdTomato紅色熒光蛋白）。研究人員觀察到硬腦膜肥大細胞表達Mrgprb2，并且通過CD31染色可見，這些細胞緊鄰血管分布（圖2A和2B）。使用常見的肥大細胞標記物親和素（avidin）進行檢測，研究人員在所有硬腦膜肥大細胞中都觀察到了tdT信號，從而證實100%的硬腦膜肥大細胞均表達Mrgprb2。

圖2 Mrgprb2在腦膜肥大細胞中表達并在tMCAO后被激活

   流式細胞術分析證實，這些tdT陽性細胞是CD117陽性和FcER1α陽性的肥大細胞，并證明Mrgprb2肥大細胞僅限于硬腦膜，而不存在于腦實質(zhì)中（圖2C）。研究人員進一步檢測了這些肥大細胞是否在卒中后遷移入腦，但在tMCAO后48小時未觀察到任何Mrgprb2肥大細胞出現(xiàn)在腦中，硬腦膜中的肥大細胞數(shù)量也無變化。這些觀察結(jié)果得到了三項獨立的小鼠全腦單細胞轉(zhuǎn)錄組研究（分別在基線狀態(tài)和缺血性卒中后）的佐證，所有研究均顯示腦中無Mrgprb2表達。這些數(shù)據(jù)表明，Mrgprb2肥大細胞駐留在其固有的硬腦膜區(qū)域，并從腦膜引發(fā)病理性腦部炎癥。

   為測量這些硬腦膜肥大細胞的活性，研究人員監(jiān)測肥大細胞附近小囊泡的釋放作為脫顆粒的標志。研究人員首先顯示，在假手術后，WT和Mrgprb2?/?小鼠的腦膜肥大細胞活化程度極低，且兩側(cè)硬腦膜的脫顆粒程度無差異。研究人員發(fā)現(xiàn)，敲除Mrgprb2能顯著降低缺血性卒中后肥大細胞的活化，因為覆蓋卒中半球的硬腦膜中，WT肥大細胞在tMCAO后的脫顆粒程度顯著高于Mrgprb2?/?細胞（圖2D和2E）。研究人員還觀察到，在tMCAO后，WT腦膜中肥大細胞特異性絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶β2(Tpsb2)的表達量高于Mrgprb2?/?腦膜，這與WT腦膜中肥大細胞活化增強相一致（圖2F）。研究人員還評估了其他肥大細胞因子作為WT腦膜炎癥負荷增加的生物標志物。盡管并非肥大細胞特異性，但分別參與單核細胞和中性粒細胞募集的趨化因子CCL2和CXCL2在WT小鼠腦膜中表達上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示Mrgprb2在促進tMCAO后腦膜普遍性炎癥中的作用。促炎標志物如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素(IL)-1β在WT小鼠tMCAO后腦膜中的表達量也呈升高趨勢。有趣的是，血管通透性標志物血管內(nèi)皮生長因子(Vegf)也上調(diào)，表明Mrgprb2可能在介導tMCAO后血管損傷中發(fā)揮作用。綜上所述，敲除Mrgprb2導致肥大細胞脫顆粒減少和細胞因子產(chǎn)生減少，證明Mrgprb2是缺血性卒中中腦膜肥大細胞活化的關鍵受體。

   為進一步闡明腦膜肥大細胞活性在卒中中的作用，研究人員通過分析中性粒細胞群體研究了腦膜炎癥環(huán)境。在卒中后6小時的早期時間點，研究人員未觀察到腦膜中性粒細胞計數(shù)存在差異，表明早期炎癥損傷在WT和Mrgprb2?/?小鼠之間沒有不同。然而，到16小時，與Mrgprb2?/?小鼠相比，WT小鼠腦膜中的中性粒細胞浸潤增加（圖2G）。值得注意的是，WT腦膜中的中性粒細胞計數(shù)緩慢下降，而在Mrgprb2?/?腦膜中則逐漸上升。至48小時，研究人員發(fā)現(xiàn)WT小鼠腦膜中的中性粒細胞數(shù)量顯著少于Mrgprb2?/?小鼠，且這種差異持續(xù)存在超過48小時。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管中性粒細胞在卒中后早期被募集到WT小鼠的腦膜中，但它們會隨時間遷移出去，而不會在腦膜內(nèi)積聚。然而，在Mrgprb2?/?小鼠中，中性粒細胞緩慢浸潤并隨時間聚集，表明它們不會像在WT小鼠中那樣顯著地遷移離開。因此研究人員推測，WT小鼠腦膜中的中性粒細胞可能轉(zhuǎn)移進入了大腦，這可能導致缺血腦內(nèi)免疫環(huán)境發(fā)生改變。相應地，研究人員接下來研究了卒中后WT和Mrgprb2?/?小鼠腦內(nèi)炎癥的結(jié)果。

3. Mrgprb2基因敲除小鼠腦內(nèi)卒中后炎癥減輕

   在評估腦部炎癥之前，研究人員首先想評估Mrgprb2肥大細胞是否介導了卒中的初始缺血性損傷。研究人員發(fā)現(xiàn)，在卒中后6小時，通過MRI檢測的腦梗死體積在WT和Mrgprb2?/?小鼠之間無顯著差異，表明Mrgprb2肥大細胞可能不參與急性缺血性損傷。研究人員進一步證明，使用神經(jīng)元損傷的間接標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)以及卒中后氧化應激標志物4-羥基壬烯醛(4-HNE)，兩種基因型的小鼠在6小時均表現(xiàn)出相似的神經(jīng)元損傷。

   為評估缺血性卒中后的急性免疫反應，研究人員通過流式細胞術測量了WT和Mrgprb2?/?小鼠卒中側(cè)和對側(cè)大腦半球中的免疫細胞群體。研究人員分析了特定先天免疫細胞群體的募集情況：首先使用泛免疫細胞標志物(CD45)和泛髓系細胞標志物(CD11b)，然后使用細胞特異性標志物（Ly6G標記中性粒細胞，Ly6C標記單核細胞/巨噬細胞）（圖3A）。研究人員還使用Iba1評估了總小膠質(zhì)細胞群體，并進一步鑒定出一個CD11b陽性小膠質(zhì)細胞亞群，該亞群被一些研究證明是損傷后增加的反應性群體。為將小膠質(zhì)細胞與中性粒細胞和單核細胞群體進一步區(qū)分開，研究人員確保這些小膠質(zhì)細胞亞群均為Ly6G陰性和Ly6C陰性。在基線狀態(tài)下，未檢測到WT和Mrgprb2?/?小鼠腦內(nèi)免疫細胞群體存在差異。此外，在卒中后6小時的早期時間點也未觀察到差異，再次證明兩種基因型小鼠的即時損傷沒有不同。

圖3 Mrgprb2基因敲除小鼠在tMCAO后腦部炎癥減輕，可通過腦膜肥大細胞移植逆轉(zhuǎn)

   相反，研究人員發(fā)現(xiàn)，在tMCAO后48小時Mrgprb2?/?小鼠卒中側(cè)大腦半球的先天炎癥反應減弱，表現(xiàn)為中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、總小膠質(zhì)細胞以及CD11b陽性小膠質(zhì)細胞的絕對計數(shù)均減少（圖3B–3D）。這些差異在由Mrgprb2+/?小鼠繁育的WT和Mrgprb2?/?同窩仔鼠中也得到重現(xiàn)，這表明這些不同的免疫表型并非不同小鼠品系造成的假象。研究人員通過免疫熒光進一步證明，這些免疫細胞浸潤至卒中半球受損的GFAP陽性組織附近，而在遠離GFAP信號的對側(cè)半球則沒有積聚（圖3E）。

   與腦內(nèi)免疫細胞募集減少相一致，研究人員發(fā)現(xiàn)，與WT卒中半球相比，Mrgprb2?/?卒中半球中趨化因子CCL2和CCL3的水平顯著降低（圖3F）。研究人員還觀察到IL-6（一種與缺血性卒中不良預后相關的細胞因子）呈下降趨勢（圖3G），以及中性粒細胞特異性蛋白酶中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)顯著減少（圖3H），NE能增加血腦屏障通透性。與腦內(nèi)免疫細胞群體的變化類似，這些細胞因子和趨化因子僅在卒中后48小時表現(xiàn)出顯著差異，而在6小時的早期損傷階段則無差異。

   鑒于已知肥大細胞在其他炎癥損傷中會募集中性粒細胞，研究人員選擇聚焦于中性粒細胞在卒中中的調(diào)控。研究人員之前顯示，CXCL2（一種由肥大細胞釋放的中性粒細胞募集主要調(diào)控因子）在WT小鼠tMCAO后腦膜中表達上調(diào)（圖2F）。相應地，研究人員證明，通過小腦延髓池注射中和抗體以阻斷CXCL2，可減弱WT小鼠（而非Mrgprb2?/?小鼠）卒中后中性粒細胞特異性向腦內(nèi)的募集。在注射對照載體的小鼠中未觀察到這種減少，表明Mrgprb2可能通過CXCL2化學趨化中性粒細胞。研究人員還發(fā)現(xiàn)，WT小鼠腦內(nèi)中性粒細胞浸潤減少的同時，伴有梗死體積減小和功能預后改善，這便將腦內(nèi)中性粒細胞特異性募集與卒中預后惡化聯(lián)系起來。

   由于Mrgprb2也在腦膜以外的結(jié)締組織肥大細胞（包括腹膜和皮膚）中表達，研究人員需要確保Mrgprb2介導腦部炎癥的作用特異性地歸因于腦膜肥大細胞。因此，研究人員將體外培養(yǎng)的WT或Mrgprb2?/?小鼠肥大細胞注射到Mrgprb2?/?小鼠的腦膜中。首先，使用Mrgprb2-tdT肥大細胞注射到非tdT的Mrgprb2?/?小鼠中，研究人員顯示，移植后tdT細胞僅在腦膜中表達（圖3I），且這些細胞未出現(xiàn)在腦或腹膜中。研究人員還觀察到腦膜肥大細胞計數(shù)增加，表明植入的細胞已在腦膜中定植（圖3J）。研究人員通過流式細胞術進一步證實，這些細胞在tMCAO后不會遷移至腦或腹膜。向Mrgprb2?/?小鼠移植WT（而非Mrgprb2?/?）腦膜肥大細胞，在tMCAO后顯著增加了腦部炎癥，表現(xiàn)為中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞募集增加（圖3K）。此外，移植WT（而非Mrgprb2?/?）腦膜肥大細胞增加了Mrgprb2?/?小鼠的梗死體積（圖3L）。這些數(shù)據(jù)表明，腦膜特異性的Mrgprb2肥大細胞的活性足以引發(fā)卒中后神經(jīng)炎癥。

4. Mrgprb2活性調(diào)控免疫細胞從顱骨骨髓向硬腦膜的募集

   顱骨骨髓是中樞神經(jīng)神經(jīng)免疫的重要免疫細胞儲存庫，在感染和損傷時為大腦特異地提供炎癥細胞來源。新研究表明，顱骨骨髓可在缺血性卒中后迅速特異性擴增。此外，顱骨骨髓與硬腦膜通過通道相連，使得免疫細胞能夠在這兩個區(qū)域之間直接轉(zhuǎn)移。因此，研究人員推測，表達Mrgprb2的腦膜肥大細胞可能在卒中后調(diào)控顱骨骨髓免疫細胞向硬腦膜的募集。

   研究人員首先確認，Mrgprb2的存在不改變基線狀態(tài)的顱骨骨髓免疫細胞群體。為了特異地研究顱骨骨髓募集的角色，研究人員將來自GFP報告基因小鼠(UBC-GFP)的顱骨瓣移植到WT或Mrgprb2?/?受體小鼠上，同時保持受體小鼠的硬腦膜完整（圖4A）。由于顱骨骨髓中沒有Mrgprb2肥大細胞，因此沒有將新的肥大細胞群體引入受體小鼠。研究人員還顯示，顱骨移植后10天，腦膜內(nèi)的中性粒細胞和單核細胞群體沒有變化，表明顱骨移植本身不會破壞硬腦膜的免疫環(huán)境。GFP信號主要保留在顱骨骨髓內(nèi)，極少泄漏到血液中，這使研究人員能夠選擇性地追蹤移植小鼠中的顱骨骨髓細胞。為確保顱骨移植本身不會誘導顯著的顱骨骨髓細胞募集，研究人員確認在移植后10天，不同基因型小鼠腦膜中的GFP陽性中性粒細胞和單核細胞沒有顯著差異。隨后，研究人員對WT和Mrgprb2?/?受體小鼠進行tMCAO手術，并在48小時后測量腦膜中的GFP信號。

圖4 Mrgprb2對中性粒細胞從顱骨骨髓遷移到大腦至關重要

   研究人員發(fā)現(xiàn)，在tMCAO后，Mrgprb2?/?小鼠硬腦膜中GFP陽性中性粒細胞的絕對數(shù)量顯著減少（圖4B）。具體來說，研究人員觀察到在Mrgprb2?/?小鼠的硬腦膜中，GFP陽性中性粒細胞占腦膜中總中性粒細胞的比例降低，這表明與野生型（WT）小鼠相比，Mrgprb2?/?小鼠無法將相同比例的顱骨骨髓中性粒細胞招募到硬腦膜中（圖4C）。同樣地，研究人員在Mrgprb2?/?小鼠的硬腦膜中也觀察到GFP陽性單核細胞的絕對數(shù)量減少。盡管趨勢如此，但WT和Mrgprb2?/?小鼠中GFP陽性單核細胞進入硬腦膜的比例并無顯著差異，這表明中性粒細胞可能是此時主要被招募的細胞。GFP陽性中性粒細胞向硬腦膜的遷移與WT小鼠顱骨骨髓中這些細胞數(shù)量的減少相關，這與Mrgprb2?/?小鼠相比更為明顯（圖4D）。這種在顱骨骨髓中觀察到的變化在中性粒細胞群體中最為顯著，表明此時主要從中性粒細胞來源招募中性粒細胞。

   總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，硬腦膜中Mrgprb2的存在可能增強中性粒細胞從顱骨骨髓儲存庫在中風后的招募。

5. Mrgprb2活性介導中性粒細胞在中風后從硬腦膜遷移到大腦

   先前的研究表明，顱骨骨髓來源的免疫細胞可以在缺血性中風后的急性階段浸潤到大腦中。因此，研究人員想要評估Mrgprb2活性是否不僅能調(diào)節(jié)顱骨骨髓向硬腦膜的遷移，還能調(diào)節(jié)其進一步浸潤到大腦中。研究人員首先確認了單獨的顱骨移植（無tMCAO）不會增加供體小鼠腦實質(zhì)中GFP陽性中性粒細胞或單核細胞的數(shù)量。在tMCAO后，研究人員發(fā)現(xiàn)許多GFP陽性免疫細胞和GFP陽性中性粒細胞（圖4E）在中風后48小時浸潤到大腦中。研究人員進一步證明，與Mrgprb2?/?小鼠相比，野生型（WT）小鼠在tMCAO后腦實質(zhì)中GFP陽性中性粒細胞的數(shù)量顯著更高（圖4F）。GFP陽性中性粒細胞與總中性粒細胞的比例在WT小鼠中也顯著更高，再次支持了這些小鼠從顱骨骨髓向腦實質(zhì)招募更大比例中性粒細胞的觀點（圖4G）。與腦膜類似，研究人員觀察到雖然Mrgprb2?/?小鼠大腦中GFP陽性單核細胞的絕對數(shù)量顯著減少，但GFP陽性單核細胞的比例并無顯著差異，這再次表明中性粒細胞可能是此時主要被招募的細胞。因此，研究人員確定Mrgprb2活性有助于中性粒細胞在中風后從顱骨骨髓遷移到硬腦膜，再從硬腦膜遷移到腦實質(zhì)中。

6. Mrgprb2肥大細胞蛋白酶裂解semaphorin，即硬腦膜-大腦通道的守門員

   雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)連接顱骨骨髓和硬腦膜的通道，但最近才提出從硬腦膜到大腦的橋接靜脈存在，并通過蛛網(wǎng)膜屏障相連。這些靜脈被蛛網(wǎng)膜袖口出口點（ACE點）包圍，由semaphorin守門，這類化學排斥分子可阻止免疫細胞通過通道移動。semaphorin表達的降低可促進免疫細胞從硬腦膜遷移到大腦。因此，研究人員假設中風后semaphorin的減少可能會增強硬腦膜中性粒細胞穿過這些橋接點并進入大腦的移動。確實，通過對腦池裂解物進行ELISA檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)中風后semaphorin3a（Sema3a），而非semaphorin3d，在WT小鼠中特異性降低，但在Mrgprb2?/?小鼠中并未降低（圖4H）。

   為了確定Sema3a的減少是否是免疫細胞從硬腦膜遷移到大腦的驅(qū)動力，研究人員假設抑制Sema3a應該會增加中性粒細胞向大腦的遷移，并加劇中風后的大腦炎癥。因此，在tMCAO后，研究人員通過小鼠的腦池給藥，使用已知的Sema3a抑制劑（Sema3a-I）來抑制ACE點界面處的Sema3a。由于Sema3a-I的IC50在0.1到0.2μM之間，研究人員在tMCAO后的6小時和24小時，以1μM的Sema3a-I對小鼠的腦池進行處理。正如預期的那樣，Mrgprb2?/?小鼠中Sema3a的抑制降低了硬腦膜中的中性粒細胞數(shù)量，并在tMCAO后48小時增加了大腦中的中性粒細胞數(shù)量（圖4I和圖4J）。大腦炎癥的增加加劇了中風體積（圖4K），并惡化了Mrgprb2?/?小鼠的功能結(jié)果（圖4L），這表明Sema3a的抑制足以使Mrgprb2?/?小鼠表型模擬WT小鼠。此外，Sema3a的抑制并未惡化WT小鼠中風后的大腦炎癥，這表明在tMCAO后，WT小鼠中Sema3a已經(jīng)被抑制。綜合這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a可能通過Mrgprb2依賴的機制被滅活。

   研究人員進一步探討了Mrgprb2介導的肥大細胞活性如何滅活Sema3a。先前的研究表明，包括肥大細胞表達的一些蛋白酶（如毛霉菌素和基質(zhì)金屬蛋白酶）在內(nèi)的多種蛋白酶可以將semaphorin裂解成較小的65kDa片段。這種裂解的Sema3a失去活性，無法作為免疫細胞的化學排斥物發(fā)揮作用。研究人員在這里表明，肥大細胞裂解物（而非成纖維細胞裂解物）可以顯著將全長Sema3a裂解為其失活形式（圖4M），這為Mrgprb2激活如何抑制Sema3a的化學排斥活性提供了一種潛在機制。為了確定tMCAO后WT小鼠中Sema3a的減少是否由于裂解所致，研究人員用已知的Sema3a蛋白酶對腦池組織進行體外處理，并評估裂解的Sema3a是否能被ELISA識別。研究人員表明，Sema3a的裂解降低了其被ELISA識別的能力，這表明tMCAO后體內(nèi)Sema3a的減少可能由肥大細胞蛋白酶裂解Sema3a所解釋。綜合這些數(shù)據(jù)支持一種模型，即Mrgprb2介導的腦膜肥大細胞活性釋放蛋白酶，使Sema3a失活，破壞關鍵檢查點，從而使硬腦膜中性粒細胞通過硬腦膜-大腦通道遷移到大腦中。

6. 人類腦膜MRGPRX2肥大細胞在中風后被激活

   接下來，研究人員探討了人類同源物MRGPRX2是否表現(xiàn)出與小鼠Mrgprb2相似的促炎活性。研究人員首先收集了非中風患者選擇性開顱手術的硬腦膜，以確定人類硬腦膜中是否存在肥大細胞，以及它們是否表達MRGPRX2。研究人員發(fā)現(xiàn)人類硬腦膜中存在表達avidin和tryptase的肥大細胞，并發(fā)現(xiàn)這些細胞確實表達MRGPRX2（圖5A和圖5B）。此外，研究人員還收集了中風和非中風患者的死后腦組織，以評估MRGPRX2肥大細胞的存在情況。雖然中風大腦中GFAP作為損傷標志物有所增加，但并未發(fā)現(xiàn)MRGPRX2或tryptase表達，這表明中風后人類大腦中缺乏表達MRGPRX2的肥大細胞，與研究人員的小鼠數(shù)據(jù)一致。

圖5 人腦膜中的MRGPRX2陽性肥大細胞在腦卒中后因SP被激活

   在確定這些細胞存在于人腦膜后，研究人員進一步探究其是否在缺血性腦卒中患者中發(fā)揮作用。研究人員收集了因惡性大腦中動脈綜合征而接受減壓去骨瓣手術的腦卒中患者的腦膜（圖5C和5D），發(fā)現(xiàn)腦卒中患者和對照組患者間的肥大細胞數(shù)量并無差異。但研究人員發(fā)現(xiàn)，與對照組患者相比，缺血性腦卒中患者的腦膜肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象顯著更嚴重（圖5E和5G），這表明人腦膜肥大細胞在腦卒中后被激活。

7.神經(jīng)肽SP是卒中后激活Mrgprb2和MRGPRX2的配體

   在確定Mrgprb2和MRGPRX2是卒中后關鍵的肥大細胞受體后，研究人員進一步探究其活性背后的配體。潛在候選者之一是SP，這是一款神經(jīng)肽，受傷害刺激時由神經(jīng)元釋放，也是已知的Mrgprb2/X2激動劑。tMCAO后小鼠大腦中的SP水平上升，且先前研究表明腦卒中患者血清中SP水平較高與死亡率較高相關。

   研究人員發(fā)現(xiàn)，腦卒中后，WT和Mrgprb2?/?小鼠的梗死半球中SP水平均升高，這表明SP源自受損的神經(jīng)元組織。這種SP在腦卒中半球中的局部增加與圖2E中看到的覆蓋腦卒中半球的腦膜肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象相吻合。為確定SP是否通過Mrgprb2介導炎癥，研究人員在tMCAO后向腦池內(nèi)注射SP或?qū)φ掌?。外源性SP使WT小鼠大腦中的中性粒細胞招募增加，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此現(xiàn)象，這表明SP通過Mrgprb2發(fā)揮作用。外源性SP還使WT小鼠的腦卒中體積增大。然而，這種腦卒中體積的增加并未使WT小鼠的行為學表現(xiàn)惡化，這表明腦卒中后內(nèi)源性SP的釋放可能足以引發(fā)小鼠的強烈行為學反應。而向Mrgprb2?/?小鼠注射外源性SP既未增加腦卒中體積，也未惡化行為學結(jié)局，這證實了腦卒中中的SP作用依賴于Mrgprb2。

   為深入探究SP在人腦卒中中的作用，研究人員收集血清樣本，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者的血清SP水平較對照組升高（圖5H）。為明確血清SP是否激活人肥大細胞，研究人員將培養(yǎng)的人WT和MRGPRX2?/? LAD2肥大細胞暴露于健康者和腦卒中患者的血清中。研究人員發(fā)現(xiàn)，與健康者血清相比，腦卒中患者血清激活并使更多WTLAD2肥大細胞脫顆粒，而MRGPRX2?/?肥大細胞被腦卒中血清激活的數(shù)量較少。無論健康者還是腦卒中患者的血清，MRGPRX2?/?和WT肥大細胞對其反應性相似，表明MRGPRX2特異性地感知腦卒中血清中存在的某種因子（圖5I）。為明確MRGPRX2是否對血清中的SP產(chǎn)生應答，研究人員預先將健康者和腦卒中患者的血清與抗SP抗體共同孵育以耗盡SP。從腦卒中血清中清除SP顯著降低了其對WTLAD2肥大細胞的激活作用，但對MRGPRX2?/?LAD2肥大細胞無影響（圖5J），這表明存在特定的SP-MRGPRX2相互作用。綜上所述，研究人員的研究表明人腦膜肥大細胞在腦卒中后被激活，部分原因是SP介導的MRGPRX2激活。

8. Mrgprb2拮抗劑減輕腦卒中后炎癥，改善行為學缺損并降低死亡率

   研究人員進而考慮是否可以通過藥理學抑制Mrgprb2來減輕腦卒中后炎癥并改善腦卒中結(jié)局。從防風果實中提取的天然香豆素-歐防風素是已知的Mrgprb2拮抗劑。研究人員確認預先用歐防風素處理可抑制WT小鼠培養(yǎng)肥大細胞的SP介導脫顆粒，但對Mrgprb2?/?小鼠無此效果（圖6A）。確認歐防風素是Mrgprb2拮抗劑后，研究人員在tMCAO誘導后6小時和24小時分別給予小鼠兩次腹腔注射，劑量為100毫克/公斤歐防風素。在tMCAO后兩天評估WT和Mrgprb2?/?小鼠大腦的炎癥情況。結(jié)果顯示，與給予對照品的小鼠相比，給予歐防風素的WT小鼠大腦中的中性粒細胞計數(shù)顯著減少，表明炎癥減輕，而Mrgprb2?/?小鼠未見這種抗炎效果（圖6B和6C）。研究人員還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歐防風素處理后，WT小鼠大腦中的單核細胞減少，CD11b陽性小膠質(zhì)細胞也呈減少趨勢，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此現(xiàn)象。這表明歐防風素通過Mrgprb2發(fā)揮抗炎作用。與tMCAO后48小時WT和Mrgprb2?/?小鼠腦膜炎癥差異一致，研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)歐防風素處理的WT小鼠腦膜中中性粒細胞更多，因為這些細胞無法進入大腦。而經(jīng)歐防風素處理的Mrgprb2?/?小鼠腦膜中性粒細胞計數(shù)未見顯著差異。

圖 6 歐防風素介導的Mrgprb2抑制減輕小鼠腦卒中后炎癥和神經(jīng)功能缺損

   為評估歐防風素介導的腦卒中后抗炎作用是否具臨床相關性，研究人員通過核磁共振成像（MRI）測量腦卒中梗死體積。與給予對照品的野生型（WT）小鼠相比，給予歐防風素的WT小鼠梗死體積顯著減小，中線移位也有所限制（圖6D和6E）。而Mrgprb2?/?小鼠即使給予歐防風素，梗死體積也未進一步減?。▓D6F）。采用28分制神經(jīng)功能評分量表發(fā)現(xiàn)，歐防風素治療的WT小鼠（而非Mrgprb2?/?小鼠）感覺運動功能缺損更少（圖6G和6H）。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，tMCAO術后30天，歐防風素治療顯著提高了WT小鼠的存活率，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此效果，這表明抑制Mrgprb2具有功能性療效（圖6G、6I和6J）。為進一步證實硬腦膜中Mrgprb2在腦卒中后腦部炎癥中的作用，研究人員在tMCAO術后6小時和24小時向WT小鼠的腦池內(nèi)局部注射低劑量歐防風素。結(jié)果顯示，局部注射歐防風素可減輕WT小鼠的腦部炎癥，減小腦卒中體積，并改善行為學表現(xiàn)。因此，研究人員的研究表明歐防風素通過依賴Mrgprb2的機制抑制腦卒中后炎癥并改善預后，這為抑制MRGPRX2可能成為治療人腦卒中后神經(jīng)炎癥的有前景的療法提供了證據(jù)。

   綜合上述數(shù)據(jù)，研究人員的研究支持以下模型：Mrgprb2是一個關鍵受體，使腦膜肥大細胞能夠通過神經(jīng)肽SP感知腦卒中的腦損傷。一旦被激活，這些肥大細胞就會通過釋放CXCL2等細胞因子，啟動從顱骨骨髓招募免疫細胞的過程。Mrgprb2信號通路進一步通過釋放蛋白酶抑制semaphorin活性，促進這些免疫細胞通過硬腦膜-大腦通道遷移到大腦實質(zhì)中。通過這些機制，Mrgprb2信號通路在缺血性腦卒中促進肥大細胞活性，進而加劇腦卒中后的病理性神經(jīng)炎癥。

研究結(jié)論

   研究人員將MRGPRX2鑒定為解決腦卒中后炎癥的特異性靶點，通過直接抑制驅(qū)動顱骨-硬腦膜-大腦炎癥軸的肥大細胞活性來發(fā)揮作用。MRGPRX2的表達和活性局限于血腦屏障外的腦膜，這使得大多數(shù)藥物遞送方法都能輕松到達。因此，MRGPRX2拮抗劑有望成為顯著減輕腦卒中后炎癥的潛在治療候選藥物。進一步研究該受體在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中的作用，可能還會揭示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病和紊亂中的潛在作用，凸顯肥大細胞作為腦膜中的哨兵免疫細胞，在調(diào)節(jié)腦-免疫界面的關鍵地位。

研究局限性

   本研究存在一些局限性，需進一步探究Mrgprb2及腦膜肥大細胞在腦卒中后腦部炎癥中的作用。首先，盡管本研究旨在了解中性粒細胞向大腦的招募，但腦卒中后會招募多種免疫細胞群體。尚不清楚這群表達Mrgprb2的腦膜肥大細胞是否會影晌腦卒中后慢性炎癥狀態(tài)中T細胞和B細胞等其他細胞群體的招募。其次，研究人員提出腦膜肥大細胞對Sema3a的調(diào)控可能促進硬腦膜中性粒細胞浸潤大腦，但肥大細胞是否調(diào)節(jié)免疫細胞浸潤大腦的其他機制仍有待闡明。

參考文獻：

Kothari et al., A mast cell receptor mediates post-stroke brain inflammation via a dural-brain axis, Cell (2025), https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.06.045.